[發(fā)明專利]一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210447668.1
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102898512A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何軍;陳代文;余冰;鄭萍;毛湘冰
• 申請（專利權(quán)）人: 何軍
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;C12P21/02;A61K38/16;A61P31/04;A61P31/10;C12R1/645
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

近年來由于經(jīng)濟與利益的驅(qū)使，濫用抗生素和超標使用抗生素的現(xiàn)象普遍存在。隨著抗生素廣泛而長期的使用，其負面作用日益凸顯，細菌的耐藥性與藥物殘留嚴重威脅著人類健康，尋求抗生素替代品勢在必行。我國現(xiàn)已開發(fā)了抗菌肽、益生素、糖萜素、低聚糖、中草藥、酶制劑、酸化劑等綠色添加劑以替代抗生素。

抗菌肽是宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類非特異性的抵抗外界病原體感染的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)?？咕囊蚱浞N類多，來源安全，抗菌活性高，抗菌譜廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，被認為是替代抗生素的理想藥物。

菌絲霉素是從腐生子囊菌假黑盤菌（Pseudoplectania?nigrella）分泌的一種抗菌肽，又稱假黑盤菌抗菌肽，由于其獨特的殺菌機制，使菌絲霉素具有細胞毒性和溶血性等危害，具有很大的藥用潛力。然而，假黑盤菌中菌絲霉素的表達量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成菌絲霉素成本高，所以利用分子生物學(xué)技術(shù)重組表達外源基因是獲取目標蛋白的有效途徑。

申請?zhí)枺?01010115167.4，發(fā)明名稱：一種菌絲霉素基因及其原核融合基因工程菌的專利申請公開了一種重組菌絲霉素的制備方法及應(yīng)用，該菌絲霉素的分子量為4401.9Da，其核苷酸編碼序列如該申請中SEQ?ID?NO.1所示。管韜等，“菌絲霉素的串聯(lián)表達及其菌內(nèi)抑菌活性分析”，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012,43（4）：620-626公開了重組菌絲霉素的串聯(lián)表達菌株，表達的融合蛋白的分子量為30、35和40KD，核苷酸編碼序列的大小為135、261和387bp。王楠，“假黑盤菌素和T4溶菌酶微生物高效表達系統(tǒng)的建立”，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文，2010年10期公開了在畢赤酵母細胞中表達和生產(chǎn)重組菌絲霉素的方法，其制備得到的穩(wěn)定表達重組菌絲霉素的工程菌株P(guān)leI，在發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，中試規(guī)模（50L發(fā)酵體系）時，重組菌絲霉素的表達量僅為0.14g/L，即140μg/ml。

現(xiàn)有技術(shù)中，研究者用不同的基因工程方法表達得到了重組菌絲霉素，但是表達水平均較低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的重組抗菌肽——重組菌絲霉素，以及編碼該重組抗菌肽的核苷酸序列，包含該核苷酸序列的重組載體、工程菌，還提供了該重組抗菌肽的制備方法和用途。

本發(fā)明重組抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述重組抗菌肽的其核苷酸編碼序列如SEQ?ID?NO.2。

本發(fā)明SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明重組載體，它包括SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。所述的重組載體優(yōu)選為pET30a重組載體。

本發(fā)明重組菌，它包括前述的重組載體。所述重組菌優(yōu)選為重組大腸桿菌。

本發(fā)明重組菌絲霉素的制備方法，它包括如下步驟：

（1）取前述重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達，離心，得菌體和發(fā)酵上清液；

（2）取步驟（1）所得菌體裂解，離心，得裂解上清液，與步驟（1）所得發(fā)酵上清液合并，分離純化，即得。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)的條件是37℃、pH6.0、300r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3~18h，誘導(dǎo)表達使用的誘導(dǎo)劑是濃度為1.0M的IPTG。進一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)時間為10h。

優(yōu)選地，步驟（2）所述分離純化采用GSTrap?FF柱層析。

本發(fā)明最后提供了前述重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明從天然菌絲霉素出發(fā)，用基因工程的方法制備得到了重組抗菌肽，該重組抗菌肽抗菌活性高，為臨床抗菌藥物提供了一種新的選擇，并且，且本發(fā)明重組抗菌肽的制備方法簡單，產(chǎn)量高，是現(xiàn)有重組菌絲霉素產(chǎn)量的12.8倍以上，經(jīng)濟效益巨大，工業(yè)應(yīng)用前景良好。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明