[發明專利]一種葡萄芽變的快速區分方法

有效

• 申請號: 201210446959.9
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102965434A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 郭大龍;張國海;侯小改;張瀟玉;郭明曉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，包括以下步驟：提取親本葡萄植株及對應的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS引物分別對DNA進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳區分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。

2.根據權利要求1所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的提取葡萄植株的DNA可以從葡萄植株的葉片、根、莖、果實或花中提取。

3.根據權利要求2所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步驟：

1）研缽預冷后，放入葉片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成細粉放入離心管并﹣20℃冷藏30min；

2）將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟1）的離心管中，使葉片組織均勻分散在緩沖液中，65℃水浴90min，每隔5min輕輕顛倒搖勻一次；

3）將步驟2）的離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心10min；

4）取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心10min；

5）取上清液，加入2倍體積的預冷無水乙醇，搖勻，﹣20℃靜置2h，4℃下4000r/m離心10min；

6）棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4℃靜置5h；

7）棄乙醇，風干5h，每管加入300μLTE緩沖液，充分溶解后，加入5μL的RNase，37℃水浴7h，得到葡萄植株的DNA。

4.根據權利要求1所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的iPBS引物是序列表SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:4的核苷酸序列的引物。

5.根據權利要求1所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的PCR擴增體系包括無菌ddH₂O、1×Buffer、2.0mmol·L^-1Mg²⁺、0.3mmol·L^-1dNTPs、0.1μmol·L^-1引物、DNA1.0ng/μL、Taq酶0.05U·μL^-1。

6.根據權利要求1所述的一種葡萄芽變的快速區分方法，其特征在于，所述的PCR擴增程序是94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，72℃充分延伸10min，其中，變性、退火、延伸三個步驟循環30次。