[發(fā)明專利]Ⅱ型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210446494.7
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN102911920A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫強(qiáng)明;趙玉嬌;潘玥;陳俊英;楊麗娟;岳耀斐;黃新偉;施海晶;丁曉潔
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

1.一種Ⅱ型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于通過下列步驟獲得：

1）、按1ml病毒液/瓶的量，將濃度為4.0MOI的Ⅱ型登革病毒液接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，于溫度為28+2℃、CO₂體積濃度為5%的環(huán)境中，恒溫吸附1小時(shí)，于相同環(huán)境中，按1:9的體積比，補(bǔ)加下列病毒維持液：RPMI-1640培養(yǎng)基?+?2%體積比的小牛血清?+?2%體積比的質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第5天，于相同環(huán)境中，按2%的體積比補(bǔ)加質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第8～9天，當(dāng)白紋伊蚊細(xì)胞C6/36病變CPE達(dá)++++時(shí)，收集細(xì)胞液，于4℃，3500×g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；

2）、將步驟1所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36上，于溫度為28+2℃、CO₂體積濃度為5%的環(huán)境中，恒溫吸附1小時(shí)，于相同環(huán)境中，按1:9的體積比，補(bǔ)加下列病毒維持液：RPMI-1640培養(yǎng)基?+?2%體積比的小牛血清?+?2%體積比的質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第5天，于相同環(huán)境中，按2%的體積比補(bǔ)加質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第8～9天，當(dāng)白紋伊蚊細(xì)胞C6/36病變CPE達(dá)++++時(shí),收集細(xì)胞液，于4℃，3500×g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；如此連續(xù)傳代培養(yǎng)三代以上，直至獲得傳代穩(wěn)定的Ⅱ型登革病毒液；

3）、按1ml病毒液/瓶的量，將步驟2所得傳代穩(wěn)定的Ⅱ型登革病毒液，接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，同時(shí)按1:9的體積比，加入下列病毒維持液：MEM培養(yǎng)基?+?5%體積比的小牛血清?+?2%體積比的質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉，于溫度為37+0.5℃、CO₂體積濃度為5%的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)至第4天，于相同環(huán)境下，按2%的體積比補(bǔ)加質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至第7天，當(dāng)人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17病變CPE達(dá)++++時(shí)，收獲已出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE的病毒液，并于-70℃下保存；

4）、將步驟3的病毒液反復(fù)凍融2次，于4℃，3500×g離心分離5min，收獲上清，得病毒液，將該病毒液按1ml病毒液/瓶的量接種到鋪滿單層、生長狀態(tài)良好且致密的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上，同時(shí)按1:9的體積比，加入下列病毒維持液:MEM培養(yǎng)基?+?5%體積比的小牛血清?+?2%體積比的質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉；于溫度為37+0.5℃、CO₂體積濃度為5%的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)至第4天，于相同環(huán)境下，按2%的體積比補(bǔ)加質(zhì)量濃度為6.6%的碳酸氫鈉溶液，培養(yǎng)至人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17病變CPE達(dá)++++時(shí)，獲得能夠在KMB17?細(xì)胞上增殖的登革病毒毒種，并于-70℃下保存；如此連續(xù)傳代培養(yǎng)三代以上，直至獲得傳代穩(wěn)定的Ⅱ型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上適應(yīng)的Ⅱ型登革病毒適應(yīng)株。

2.如權(quán)利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述每瓶的細(xì)胞數(shù)量為1～1.7×10⁶。

3.如權(quán)利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述步驟1）的白紋伊蚊細(xì)胞C6/36經(jīng)過下列傳代培養(yǎng)：按常規(guī)在細(xì)胞中加入下列細(xì)胞生長液：RPMI-1640培養(yǎng)基加10%體積比的小牛血清；放置于溫度為28+2℃，CO₂體積濃度為5%的環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天換液一次，培養(yǎng)4-5天細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層。

4.如權(quán)利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述步驟3）的人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17經(jīng)過下列培養(yǎng)：按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對KMB17細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所用細(xì)胞生長液為：MEM培養(yǎng)液加10%體積比的小牛血清，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞長成形態(tài)良好致密單層。