[發(fā)明專利]一種用于刪除轉(zhuǎn)基因水稻中選擇標記的熱激方法

無效

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• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN103798124A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設計）人: 張建福;謝華安;許惠濱
• 申請（專利權(quán)）人: 張建福;謝華安;許惠濱
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;A01G7/06;C12N15/82
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技術領域

本發(fā)明涉及一種用于刪除轉(zhuǎn)基因水稻中選擇標記的熱激方法，該方法在不傷害植株的前提下能有效刪除轉(zhuǎn)基因植株中的選擇標記，從而避免標記基因?qū)χ参锷L發(fā)育帶來負面影響，亦為目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應用奠定基礎。

發(fā)明背景

隨著植物基因工程技術的發(fā)展，許多種類的植物可以通過遺傳轉(zhuǎn)化方法使其性狀得以改良或作為生物反應器生產(chǎn)有用的蛋白。為了便于區(qū)分將轉(zhuǎn)化植株與非轉(zhuǎn)化植株，選擇標記基因成為轉(zhuǎn)化載體的必要組成部分。目前使用較多的選擇標記基因有抗生素抗性基因和除草劑抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、草甘膦除草劑抗性基因等。

然而，一旦獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物，選擇標記基因便失去了在轉(zhuǎn)化植株中繼續(xù)存在的必要性，并且還可能產(chǎn)生以下不利因素：1.選擇性標記基因的存在可能一起轉(zhuǎn)基因植物中目的基因發(fā)生基因沉默。2.環(huán)境安全問題。主要是選擇標記基因在不同生物間的水平轉(zhuǎn)移，可能引起對生態(tài)平衡的破壞。3.轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化推廣，由此衍生而來的轉(zhuǎn)基因食品數(shù)量在不斷增加。雖然目前尚無確切的證據(jù)表明轉(zhuǎn)基因食品會對人體產(chǎn)生不利的影響，但是目的基因以外的其他基因的存在尤其是抗性基因的存在會引起公眾對健康的擔心。

目前，利用共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、位點特異性重組系統(tǒng)等均可實現(xiàn)取出轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記基因的目的。位點特異性系統(tǒng)主要由2個組分組成：位點特異性重組酶和重組位點。主要有Cre/loxP或者Ftp/FRT兩個重組系統(tǒng)，并且已發(fā)展成為在體內(nèi)、外進行遺傳操作的有力工具。

Cre/loxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體，可以介導位點特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分：①一段長34bp的DNA序列，含有兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶識別的位點，被稱為loxP位點(locus?of?X-over?in?P1)。②Cre重組酶(cyclization-recombination)，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)loxP位點的DNA重組。利用該重組系統(tǒng)可以通過Cre重組酶識別特定DNA位點，將特定的一段DNA順序(處于同向lox位點之間的DNA片段)刪除掉。如果將一個阻斷序列置于啟動子與讀碼框之間，這一基因就不會表達。一旦刪除了阻斷序列，這個基因就會在啟動子的調(diào)控下表達。這里Cre基因的啟動就通過對阻斷序列的刪除起到一個開關的作用。利用這一技術北京大學林忠平教授的實驗室利用誘導性表達的啟動子驅(qū)動Cre重組酶的表達，例如利用熱激(heat?shock)誘導表達啟動子使得轉(zhuǎn)基因植物中重組酶基因在熱激反應之下將事先設計好的標記基因從轉(zhuǎn)基因植物中刪除。

本研究所涉及的Cre/loxP系統(tǒng)就是利用熱激(heat?shock)誘導表達啟動子使得轉(zhuǎn)基因植物中重組酶Cre基因表達，在導入反義的脂肪氧化酶基因及標記基因之后，在熱激處理之下將lox位點之間的標記基因，連同Cre基因(啟動子、Cre編碼序列及終止子)一起刪除。余下的是水稻胚乳專一性啟動子驅(qū)動下的反義的水稻脂肪氧化酶基因。即我們獲得的轉(zhuǎn)基因水稻，選出所需株系后，做種子的熱激處理，可刪除轉(zhuǎn)基因植株中兩個lox之間的DNA片段。由于熱激處理對植物材料傷害較大，且每次熱激周期較長，因此要在保證熱激效果的前提下摸索合適的熱激次數(shù)和溫度，確保在對轉(zhuǎn)基因植株的傷害降到最低的前提下提高轉(zhuǎn)基因植株中的選擇標記刪除效率。李巖(2011)在《ipt基因促進矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化效率及熱激啟動子驅(qū)動基因刪除》(基因組學與應用生物學)中研究了熱誘導外源基因刪除表達載體在矮牽牛中的基因刪除效果，報道了目前最高的熱激刪除效率約為43.8％，刪除效率仍需進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的不足，目的在于探索一種能有效刪除轉(zhuǎn)基因水稻中的選擇標記的方法并確保對轉(zhuǎn)基因植株的傷害降到最低，為培育具有生物安全的轉(zhuǎn)基因水稻新品種提供一個新途徑，為安全、高效的轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎。

附圖說明

圖1激啟動子驅(qū)動Cre基因載體工作過程原理圖。

圖2農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化秈稻及抗性植株再生流程。A、愈傷組織誘導，B、愈傷組織繼代，C、愈傷組織篩選，D、抗性愈傷組織，E、預分化，F(xiàn)、分化成苗，G、生根培養(yǎng)，H、煉苗，I、移栽田間

圖3抗性植株中Bar基因的PCR檢測。M：2000bp?DNAmarker；?1-12：抗性植株；13：野生型植株；14：陽性對照

圖4轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測。1：陽性對照；2：非轉(zhuǎn)基因植株；3-7：轉(zhuǎn)基因植株