[發明專利]快速制備人外周血淋巴細胞早熟凝集染色體的方法

有效

• 申請號: 201210444240.1
• 申請日: 2012-11-09
• 公開（公告）號: CN103805564A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉青杰;高玲;陸雪;陳德清
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞遺傳學領域，具體涉及人外周血淋巴細胞早熟凝集染色體的制備方法。

背景技術

早熟凝集染色體(Premature?Condensed?Chromosome，PCC)最經典的概念是指將處于分裂期(M期)的細胞與處于細胞周期其他階段的細胞融合，其他期細胞的染色質提早包裝成染色體。由于G1、S、G2的DNA復制狀態不同，早熟凝集的染色體的形態各異，如與M期細胞融合的G1期的染色體為單線狀，S期為粉末狀，G2期染色體為雙線。

早熟凝集染色體PCC作為輻射劑量估算的方法，受到了廣泛的關注和認可。早熟凝集染色體比常規染色體法具有很強的優勢：①可誘導靜止期細胞的分裂，可大大增加分析細胞的數量，避免了常規染色體畸變分析中只對分裂期細胞進行選擇性分析的不足；②得出的染色體損傷為原始損傷，有利于觀察到局部照射或“旁效應”輻射能量在細胞內的直接或間接沉積，增加了適用的劑量評估范圍，提高了方法的敏感性和結果的準確性；③PCC操作簡便、省時，而常規染色體分析需要豐富的經驗和熟練的技巧，且給出劑量的時間需4-5d，對大批傷員不能及時提供劑量估算。因此使用PCC用于估算受照人員的輻射劑量，在大劑量的輻射事故中，可以提供足夠的可供分析的染色體。④PCC還有其它優勢，比如與受照劑量有嚴格的定量關系，以及用離體實驗建立的劑量效應刻度曲線與整體實驗所得到的劑量效應曲線無顯著性差異(Gotoh?E，Tanno?Y，Takakura?K.Simple?biodosimetry?method?for?use?in?cases?ofhigh-dose?radiation?exposure?that?scores?the?chromosome?number?ofGiemsa-stained?drug-induced?prematurely?condensed?chromosomes(PCC).Int?J?Radiat?Biol.2005，81(1)：33-40.)。

但是早期的細胞融合方法制備PCC細胞費時、技術要求高、PCC產額低、不穩定等限制了它作為生物劑量計的應用。最近，一些具有促進細胞分裂作用物質的發現和應用，取代了過去傳統PCC中的細胞融合技術，使制備PCC對技術的要求大為降低，縮短了分析時間，如岡田酸(okadaicacid)和花萼海綿誘癌素A(calyculin?A)。岡田酸可使外周血淋巴細胞在G1、G2和M期發生PCC，但是，誘導PCC過程中的淋巴細胞培養階段都需要至少48小時。calyculin?A可誘導任一時相的細胞發生PCC，大大提高了可用于分析細胞的數目(Prasanna?PG，Escalada?ND，Blakely?WF.Induction?of?premature?chromosome?condensation?by?a?phosphataseinhibitor?and?a?protein?kinase?in?unstimulated?human?peripheralblood?lymphocytes：a?simple?and?rapid?technique?to?study?chromosomeaberrations?using?specific?whole-chromosome?DNA?hybrid.Mutat?Res，2000，466(2)：131-41.)，但誘導PCC過程中的淋巴細胞培養階段時間仍需大約48小時。

發明內容

本發明的目的在于建立快速制備人外周血淋巴細胞早熟凝集染色體的方法，以解決現有技術制備人外周血淋巴細胞早熟凝集染色體耗時長的問題。

本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現：

快速制備人外周血淋巴細胞早熟凝集染色體的方法，包括如下步驟：

(1)、植物凝血素處理(PHA)：采集3-5ml血樣，向血樣中加入植物凝血素至終濃度80-120μg/ml，混勻后置于37℃恒溫培養箱內靜置45-90分鐘；

(2)、混合培養：將植物血凝素處理后的血樣離心，取中層分界處的淋巴細胞，置于含有250μg/ml秋水仙素、10mmol/L?ATP、5％胎牛血清、500nmol/L?CalyculinA以及0.2mg/ml?CDK1/CyclinB的混合培養液中，混勻后置于37℃恒溫培養箱內靜置培養3-12小時；

(3)、細胞低滲處理：細胞混合培養后，離心棄上清，使用0.075molKC13-5ml低滲10-20分鐘；