[發明專利]檢測貝氏柯克斯體的專用引物

無效

• 申請號: 201210443081.3
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號: CN102925574A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 王錫樂;溫博海;熊小路;齊永;段長松;李佳明;焦俊;賈引軍;龔文平
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測貝氏柯克斯體的專用引物。

背景技術

貝氏柯克斯體是1935年首次從澳大利亞病人中分離到的立克次體樣病原體，屬專性胞內寄生、革蘭氏陰性嗜酸菌。貝氏柯克斯體所致疾病稱為Q熱（Q?fever）。Q熱分為急性和慢性兩種臨床類型。急性Q熱表現為急性流感樣癥狀，以頭痛、發熱、肺炎為主要特征，而慢性Q熱主要表現為長期發熱，常伴有心內膜炎、肝炎、骨髓炎等。貝氏柯克斯體的感染劑量極低，單個病原體即可致病，因此該病原體已被某些國家用作生物武器、還可能被恐怖組織用作生物恐怖劑。目前已經報道的Q熱病例遍及全球各大洲幾乎所有國家，成為當前分布最廣的人獸共患病之一。傳統的普通PCR和實時熒光定量PCR方法等常需要花費較長時間或者需要特定的儀器，難以滿足暴發疫情快速診斷的需要。

環介導等溫擴增法（loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）具有在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏的擴增靶序列的特點。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環介導等溫擴增引物組。

本發明提供的檢測貝氏柯克斯體的環介導等溫擴增引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物組中，引物1、引物2、引物3和引物4的摩爾比為1：1:8：8。

本發明的另一個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環介導等溫擴增試劑。

本發明提供的檢測貝氏柯克斯體的環介導等溫擴增試劑，包括上述的引物組和環介導等溫擴增緩沖液。

上述環介導等溫擴增試劑由上述的引物組、環介導等溫擴增緩沖液和水組成；

所述引物1和所述引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為5pmol/L，

所述引物3和所述引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為40pmol/L。

本發明的第三個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環介導等溫擴增試劑盒。

本發明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的環介導等溫擴增試劑。

上述的引物組、上述的環介導等溫擴增試劑、上述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測貝氏柯克斯體產品中的應用也是本發明保護的范圍。

上述應用中，所述檢測為環介導等溫擴增反應，所述環介導等溫擴增反應的條件為：60-65℃反應30-90min，具體為63℃反應90min；再80℃5min終止反應。

上述檢測和/或輔助檢測貝氏柯克斯體為用上述環介導等溫擴增試劑對待測樣本（貝氏柯克斯體）進行環介導恒溫擴增反應，檢測環介導恒溫擴增反應產物；

上述檢測環介導恒溫擴增反應產物可通過如下方法判斷：

1）通過反應液的濁度進行分析判定：核酸大量合成時，dNTP會析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg²⁺(或Mn²⁺)結合，產生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應液的濁度變化；基于該原理，可以根據反應液的濁度變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列；若渾濁，則為陽性，反之為陰性；

2）采用實時濁度儀及其配套程序軟件實時檢測反應液，若實時濁度儀上觀察到典型的擴增曲線，則表明待測樣本來自貝氏柯克斯體，為陽性，反之為陰性。

本發明的實驗證明，本發明發現了4條專用引物，采用環介導等溫擴增法可對貝氏柯克斯體進行特異性檢測和定量分析，本發明的引物和方法具有如下優點：（1）只需在恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊設備；（2）特異性高；（3）快速高效，擴增反應在60分鐘內即可完成；（4）靈敏度高；（5）鑒定方便簡單。本發明的引物適用于臨床標本的快速檢測。

附圖說明

圖1為實施例2的靈敏度檢測的實時濁度儀擴增結果和擴增曲線。

圖2為實施例2的特異性檢測的實時濁度儀擴增結果。

圖3為實施例2的重復性檢測的實時濁度儀擴增結果（A）以及擴增曲線（B）。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。