[發明專利]一種C-反應蛋白及其制備和應用

有效

• 申請號: 201210442436.7
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號: CN103012576A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 孫黎;李墨非
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P7/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種C－反應蛋白及其制備和應用。?

背景技術

C－反應蛋白(C-reactive?protein)是穿透素（pentraxin）家族的一個成員。C－反應蛋白是由肝臟產生，在人類中它是一個經典的急性期反應蛋白，在炎癥反應等急性條件下其濃度在血清中可升高上千倍，因此在臨床上被用作疾病的指示。在免疫學上，C－反應蛋白是一種模式識別受體，為天然免疫系統的重要組成成分。C－反應蛋白能在鈣離子存在的條件下特異性結合磷酸膽堿基團，從而與各種細菌結合。C－反應蛋白與細菌的結合可誘發系列免疫調控反應，包括激活補體、促進細胞的吞噬等，因此C－反應蛋白在疾病的免疫防控中具有應用價值。目前，C－反應蛋白已在多種魚類中發現，但是其功能和應用性研究尚缺乏。?

發明內容

本發明目的在于提供一種C－反應蛋白及其制備和應用。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種C－反應蛋白為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。?

C－反應蛋白的制備方法，?

1）質粒pCsCRP的構建：?

以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物純化后與質粒T-Simple進行連接，連接混合液轉化大腸桿菌后在含安卡青霉素、Xgal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培養基上培養2－8h,篩選轉化子提取質粒，得重組質粒pTSCRP；?

將pTSCRP用Sma?I酶切，回收0.6kb片段，連接于pET259，連接液轉化入大腸桿菌，在含卡那霉素的LB培養基上培養18－24小時,篩選轉化子提取質粒，即為pCsCRP；?

2）C－反應蛋白的制備?

將上述步驟1）的質粒pCsCRP轉化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培養基上培養,篩選轉化子即為BL21/pCsCRP；將BL21/pCsCRP用終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達后，采用親和層析柱純化重組蛋白，即為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示的C－反應蛋白。?

所述步驟1）中F1為5’-CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAGA?-3’；R1為5’-CCCGGGGTAGCACTGTGTTACTCTATC-3’。?

C－反應蛋白的應用，所述C－反應蛋白與細菌結合作為制備激活外周血白細胞的藥物中的應用。所述C－反應蛋白與革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌結合。?

所述革蘭氏陰性細菌為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella?tarda）、大腸桿菌（Escherichia?coli）或鰻弧菌（Vibrio?anguil?larum）；革蘭氏陽性細菌為海豚鏈球菌（Streptococcus?iniae）。?

本發明具有如下優點：本發明的C－反應蛋白能夠與革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌結合并且對外周血白細胞具有顯著的激活能力。所得蛋白在抗細菌感染中具有應用潛能。?

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的純化得到的C－反應蛋白電泳圖譜（其中，純化得到的C－反應蛋白為泳道2；泳道1：分子量marker）。?

圖2為本發明實施例提供的C－反應蛋白激活外周血白細胞能力檢測結果圖。?

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。?

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：?

1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。?

2.大腸桿菌用Hanahan方法（Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press?2001）；酵母轉化按Invitrogen公司的方法（Catalog?no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）按照Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Pres?s2001。?

3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。?