[發明專利]基于微流控芯片的體外血腦屏障模型的建立與表征方法

無效

• 申請號: 201210438687.8
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN102978109A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 秦建華;許慧;馬慧朋
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/071
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種微流控芯片，其特征在于：該微流控芯片主要包括細胞入口池(1)、膠原入口池(2)、細胞培養室(3)和廢液池(4)；細胞培養室(3)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(3)下連廢液池(4)，每個膠原入口池分別含有4個觀察小室，膠原入口池與細胞培養室(3)聯通。

2.按照權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。

3.按照權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理45-60s進行不可逆封接。

4.按照權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成，細胞入口池(1)、細胞培養室(3)、廢液池(4)高度為膠原入口池(2)高度的三倍。

5.按照權利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述膠原入口池(2)高度約為50μm；細胞入口池(1)、細胞培養室(3)、廢液池(4)高度為150μm。

6.一種基于權利要求1所述的微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于：方法過程如下：

(1)腦膠質瘤細胞條件培養液的制備

將腦膠質瘤細胞消化后，以5×10⁵-1×10⁶cells/mL密度接種入6孔板，恒溫培養箱中培養24-36小時之后，棄去培養液，向孔板中加入無血清細胞培養液，恒溫培養箱中繼續培養48小時，收集該培養液備用；

(2)芯片內膠原的灌注

用移液器將配制好的膠原工作液注入膠原入口池(2)，將固定芯片的培養皿放入恒溫培養箱中孵育30-45分鐘，促使通道內膠原由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠結束后，細胞入口池(1)、細胞培養室(3)和廢液池(4)中加入新鮮的細胞培養液；

(3)芯片內細胞接種及血腦屏障模型的建立

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)經消化后，調整合適的細胞密度，取10-20μL細胞懸液加入細胞入口池(1)內，從廢液池端迅速吸出10-20μL細胞培養液，促使細胞在重力流的作用下快速、均勻地進入細胞培養室(3)；當在光學顯微鏡下觀察到細胞培養室(3)中的細胞均勻分布時，立即將芯片豎立，并移入恒溫培養箱中放置，豎立方向為細胞培養室(3)在上，膠原入口池(2)在下；豎立放置8min后，取出觀察，如果細胞緊貼于細胞觀察室交界面，說明細胞接種成功；將芯片放平，向通道加入先前收集的腦膠質瘤細胞的條件培養液，移入恒溫培養箱中繼續培養48-60小時，每隔12-24小時換液一次；

(4)血腦屏障模型的結構表征及功能評價

常規免疫熒光染色法表征模型細胞表面緊密連接蛋白的表達；

以小分子(MW=557.47)熒光物質為探針，表征血腦屏障模型的滲透性，向細胞入口池(1)內加入小分子熒光物質溶液，分別測定0min、15min、30min后膠原入口池的4個觀察室內的熒光強度。

7.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于：所述步驟（2）芯片內膠原灌注時，膠原工作液加入膠原入口池(2)，每孔0.4μL；之后再加1mL?PBS緩沖液于培養皿中。

8.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于：所述腦膠質瘤細胞條件培養液的作用是對內皮細胞進行刺激，使其形成類似血腦屏障的細胞間緊密連接。

9.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于：所述步驟（3）芯片內細胞接種時，所調整的細胞密度為5×10⁶-1×10⁷cells/mL。

10.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于：所述的細胞表面蛋白表達檢測的方法為常規細胞免疫熒光染色。