[發明專利]檢測殘留齊帕特羅的酶聯免疫試劑盒及其使用方法

無效

• 申請號: 201210438110.7
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN103808921A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 杜道林;洪霞
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531;G01N21/31;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了一種檢測動物組織及其代謝物中齊帕特羅的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked?Immunosorbent?Assay，ELISA?)技術領域。本發明涉及用于檢測動物源食品、血液及尿液中殘留的齊帕特羅的含量的酶聯免疫試劑盒及使用該試劑盒的檢測方法。?

背景技術

?β₂-腎上腺素受體激動劑能增加肌肉/脂肪比，此類物質被用于動物養殖中時，可明顯提高飼養動物瘦肉率。但大量使用或長期超量使用，且不遵守安全停藥期，則會在飼養動物組織中蓄積，人食用了這種動物組織后會引起中毒甚至死亡，因此很多國家和國際組織已經禁止這類化合物用于食品動物飼養。齊帕特羅(Zilpaterol)是一種新型β₂?-腎上腺素能激動劑，其化學結構?(見式?1)與常見的苯胺類-腎上腺素類激動劑(克侖特羅和沙丁胺醇)和苯酚類β?-腎上腺素類激動劑?(萊克多巴胺)是完全不同的，它的作用效果相當于克侖特羅的十分之一，但比萊克多巴胺更有效。在墨西哥和南非齊帕特羅被允許作為宰殺期牛的飼料添加劑使用，但是在歐盟被明令禁止使用。?

式?1?齊帕特羅的化學結構?

目前，歐盟國家對齊帕特羅使用和動物組織中殘留方面的研究較多實驗方法涉及氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜-串聯質譜法等。氣質聯用法均需要對樣品進行衍生，?操作步驟多，實驗時間長，而高效液相色譜-串連質譜法對儀器設備要求高，通常需要利用氘代內標物質，實驗步驟較復雜。因此，建立一種簡單、快速、準確、可靠的檢測方法，對齊帕特羅的使用進行監控是非常必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。

現有技術對于齊帕特羅的檢測主要是高效液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些方法的檢測過程繁瑣、檢測時間長，需要的設備昂貴，操作復雜，難于推廣。根據我國目前已經形成的一套獸藥殘留監控檢測技術，ELISA作為一種準確、靈敏性、高性價比的檢測方法，是食品安全監測、獸藥殘留監測領域進行篩選的理想方法。本發明通過特有的免疫動物制備具有高親和力、高特異性的齊帕特羅抗體，建立一種可以檢測齊帕特羅的間接競爭ELISA檢測方法。本方法具有操作簡便、快捷，靈敏度高、特異性好等特點。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題：提供一種能夠快速且準確的檢測出殘留齊帕特羅的酶聯免疫試劑盒。本發明所要解決的另一個技術問題是提供以一種操作簡單、耗時短、檢測靈敏度高且適用于大批量樣品檢測的檢測殘留齊帕特羅的方法。?

為解決所述技術問題，經過大量實驗研究分析，本發明提供了以下技術方案來解決所述技術問題：?

一種檢測殘留齊帕特羅的酶聯免疫試劑盒，包括酶標板96孔、齊帕特羅標準品工作液各1?mL、齊帕特羅抗體工作液7?mL、齊帕特羅酶標二抗工作液12?mL、底物液12?mL、終止液7?mL、濃縮洗滌液40?mL和濃縮樣品稀釋液40?mL；

其中，所述酶標板是包被齊帕特羅抗原的酶標板，齊帕特羅抗原是用0.05?mol/L?pH?9.6的碳酸鹽包被緩沖液(CBS)稀釋成1:8000比例，100?μL/孔，37℃，2h，取出4℃放置過夜；取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300?μL/孔，洗板3次，1min/次；然后加入0.5%?BSA封閉，150?μL/孔，37℃放置2?h；取出酶標板甩掉板內液體，用潔凈的毛巾包裹后拍干板內殘留液體；將拍干后的酶標板整齊地擺放置GMP車間恒溫（25℃）晾干；抽檢要求板內孔與孔之間，板間的OD值變異系數均小于10%；檢驗合格后將酶標板密封后置4℃下保存；

其中，所述齊帕特羅標準品的濃度分別為0?ng/mL、0.1?ng/mL、0.3?ng/mL、0.9?ng/mL、2.7?ng/mL、8.1?ng/mL；

其中，所述齊帕特羅抗體工作液是用抗體稀釋液稀釋成1:10000比例；

所述齊帕特羅酶標二抗工作液是用酶標二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；

所述底物液包含0.05?mol/L的NaHPO₄·12H₂O、0.025?mol/L的一水檸檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、0.2?mmol/L的3，3，5，5-四甲基聯苯胺(TMB）、0.5?mmol/L的過氧化氫脲和5%的N，N-二甲基甲酰胺；