[發明專利]利用連作土壤浸提液選育草莓抗連作障礙新種質的方法

在審

• 申請號: 201210436739.8
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN103798135A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 甄子萱;李曉慕;張宇航;齊永志
• 申請（專利權）人: 甄子萱;李曉慕;張宇航;齊永志
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N61/00;A01P21/00
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技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種利用連作土壤浸提液作為選擇壓力選育草莓抗連作障礙新種質的方法。?

背景技術

草莓[Fragaria?ananassa?Duch.]素有“漿果皇后”的美稱，是最受人們喜愛的水果之一。2010年，中國草莓栽培總面積和總產量分別約為11.7萬公頃和200萬噸，均居世界第一位。由于耕地數量的限制，草莓連作現象十分普遍。連作會導致草莓生長發育不良、生育期推遲、根部病害加重、產量和品質急劇下降，導致該變化的原因在一定程度上是由于草莓自身分泌或腐解產生的一些水溶性次生代謝物質所致，該類物質會在土壤中逐年積累并對草莓產生毒害作用。毒害作用的表現依賴于分泌到土壤中的代謝物質，毒害物質的生理活性隨土壤類型和植物生長年限不同而表現出時空差異。據報道，草莓根系分泌物和腐解物中含有對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸和苯甲酸六種酚酸；其中，對羥基苯甲酸含量最高，對草莓生長的抑制作用最強；其次是苯甲酸。草莓連作土壤中的毒害物質‘對羥基苯甲酸’的含量會隨著連作年限的延長而逐漸積累，連作2年土壤其含量約為0.0078mg/g，9年連作土壤中其含量高達0.0284mg/g。研究亦發現牧草區土壤浸提液能明顯抑制蘿卜種子的萌發和幼苗的根系活力；臭椿根部土壤提取液對白蠟和刺槐幼苗的生長指標和生理指標也均表現出較強的抑制作用。?

連作障礙已嚴重制約了草莓的可持續發展，要想改變這種不利局面的最為直接、經濟有效的措施就是培育抗連作障礙草莓新品種。迄今為止，生產上還沒有抗連作障礙的草莓品種。我國草莓新品種的選育工作起步較晚，生產上主要是通過國外引種、雜交育種和誘變育種篩選豐產、耐貯運、抗病等優質品種。前兩種方法已在草莓選育新品種方面應用的較為廣泛，但誘變育種還存在明顯不足，其主要是采用草莓組織培養與化學誘變劑秋水仙素或?⁶⁰Co輻射處理相結合的方法選育新品種。迄今為止，關于利用草莓連作土壤浸提液誘變選育抗連作草莓品種還缺乏系統研究。?

本研究首先以草莓匍匐莖尖生長點為愈傷組織材料，以9年連作土壤浸提液的系列梯度濃度稀釋液作為選擇壓力進行誘變處理，根據草莓莖尖生長點存活率確定土壤浸提液稀釋液對莖尖生長點的亞致死濃度；然后再在含有亞致死濃度的MS培養基上離體誘變獲得抗連作障礙草莓新種質。篩選抗連作障礙草莓新種質對解決草莓生產中連作障礙問題具有重要?的理論和實踐意義。?

發明內容

本發明目的在于提供一種利用連作土壤浸提液離體誘變選育草莓抗連作障礙新種質的方法，其以草莓匍匐莖莖尖生長點為誘導材料，以土壤浸提液的亞致死濃度為選擇壓力，研究愈傷組織形成、生長、分化穩定的特性；再通過抗性不定芽再生植株在連作土壤中的生長狀況，如生長發育指標、和根系病情指數等，最終建立以土壤浸提液選誘變育草莓抗連作障礙新種質的方法。?

技術方案：?

1、無菌連作土壤浸提液的配制?

取草莓連作耕作層土壤500g，風干后研磨并過50mm篩，按體積比1∶4加入95％乙醇搖床(200rpm、25℃)震蕩提取36h，提取液用95％乙醇定容至500mL，以3000rpm/min離心30min，取上清液旋轉蒸發(42℃)蒸干，用無菌水將其溶解，最后定容至10mL，0.45μm微孔濾膜過濾后備用。?

2、土壤浸提液誘導亞致死濃度的確定?

挑取草莓栽培品種匍匐莖莖尖的生長點，接種在MS繼代培養基上進行光照培養。待生長點長出叢生芽后，分別接種單株不定芽在各含無菌土壤浸提液1.0×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5和1.0×10^-6母液濃度的MS固體誘導培養基中；光照培養條件：18～28℃、光周期14/10h(光/暗)、相對濕度為50％～75％，據成活率確定浸提液亞致死濃度。?

3、抗連作障礙新種質的初篩?

將步驟2中單株不定芽首先接種在含亞致死濃度培養基上連續培養2次后，將2次培養均能存活的不定芽定為抗性不定芽；標記后將抗性不定芽接種在含浸提液亞致死濃度的MS培養基上，繼代培養5代后；再將其接種于連作土壤浸提液濃度高一梯度的MS培養基上繼續繼代培養5代，每代周期為30d，篩選得抗性再生植株。?

4、抗連作障礙新種質的復篩?