[發(fā)明專利]白地霉ZJB-09214及在生物催化合成L-色氨酸中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210435815.3
• 申請(qǐng)日: 2012-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN102936571A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭裕國(guó);鄭仁朝;沈寅初
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12P13/22;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及色氨酸合成方法，特別涉及一種產(chǎn)酰胺酶的新菌種——白地霉ZJB-09214（Geotrichum?candidum?ZJB-09214）及在生物催化制備L-色氨酸中的應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

酰胺酶（Amidase,?EC3.5.1.4）是一類催化酰胺C-N鍵水解生成相應(yīng)羧酸和氨的重要生物催化劑。酰胺酶底物譜廣，能高效催化各種非天然脂肪族、雜環(huán)及芳香族酰胺的水解，并具有高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性和不需輔酶等優(yōu)點(diǎn)，在制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)手性羧酸及酰胺衍生物中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此，獲得酰胺酶新酶源在手性生物合成中具有十分重要的價(jià)值。

目前已報(bào)道的酰胺酶產(chǎn)生菌主要為Rhodococcus、Bacillus、Pseudomonas、Paracoccus、Comamonas、Pseudonocardia等細(xì)菌（Rev.?Environ.?Sci.?Biotechnol.?2009，8:?343-366）。僅Prasad和Linardi等報(bào)道了少數(shù)產(chǎn)酰胺酶的酵母如Kluyveromyces?thermotolerans、Candida?famata等（World?J.?Microbiol.?Biotechnol.?2005，21:?1447-1450，F(xiàn)EMS?Microbiol.?Lett.1996,?15:67-71）。

色氨酸化學(xué)名為α-氨基-β-吲哚丙酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。L-色氨酸是人和動(dòng)物所需的重要限制性氨基酸之一，參與肌體蛋白質(zhì)合成和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，在生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。因此，L-色氨酸被廣泛用于醫(yī)藥、飼料和食品等行業(yè)，是繼蛋氨酸、賴氨酸之后的第三大飼料添加用氨基酸。通過添加L-色氨酸，能夠調(diào)節(jié)日糧中氨基酸的平衡，促進(jìn)禽畜的生長(zhǎng)。L-色氨酸生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶促轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價(jià)原料為碳源，利用谷氨酸棒桿菌、枯草桿菌生產(chǎn)L-色氨酸，但合成途徑長(zhǎng)，代謝流較弱，且需多種前體物質(zhì)。化學(xué)合成法主要有直接以吲哚為原料及在合成過程中生成吲哚兩大類。該法反應(yīng)條件復(fù)雜，周期長(zhǎng)，污染嚴(yán)重，不宜工業(yè)化生產(chǎn)。酶促轉(zhuǎn)化法具有終產(chǎn)物積累量高、反應(yīng)周期短、分離提純?nèi)菀椎葍?yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)廉價(jià)L-色氨酸的有效方法。酶促工藝中涉及的酶催化劑主要有氨基酸酰化酶、轉(zhuǎn)氨酶、海因酶、色氨酸酶、絲氨酸消旋酶和色氨酸合成酶等。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種新菌株——白地霉ZJB-09214，及其在生物轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

白地霉ZJB-09214?（Geotrichum?candidum?ZJB-09214）保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)?武漢?武漢大學(xué)，保藏日期2012年3月7日，保藏編號(hào)CCTCC?No：M?2012063。

本發(fā)明所述白地霉ZJB-09214是通過以下程序篩選得到的：

1)?將從浙江省杭州市周邊地區(qū)采回的土樣1.0?g加入生理鹽水中，用振蕩器充分打散均勻并接種到富集培養(yǎng)基，在30℃、150?rpm下，搖床培養(yǎng)4~5天后，移取2?ml富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新鮮的富集培養(yǎng)基中，再在同樣條件下培養(yǎng)4~5天，如此重復(fù)3~4次；富集培養(yǎng)基終濃度組成為(g/L):?葡萄糖?6.0、K₂HPO₄?2.0、NaCl?1.0、MgSO₄·7H₂O?0.2、FeSO₄·7H₂O?0.01、生物素?0.001、鹽酸硫胺?0.001、丙烯酰胺2.0，pH?7.0，溶劑為水。

2)?取最后一次富集培養(yǎng)液用質(zhì)量濃度0.85%生理鹽水稀釋10⁶~10¹⁰倍后涂布到平板培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)2天，獲得菌體斜面。平板培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度1.7%的瓊脂。斜面培養(yǎng)基終濃度組成為（g/L）：KH₂PO₄?1.0，MgSO₄·7H₂O?0.5，?NaNO_3?2.0，KCl?0.5，F(xiàn)eSO_4?0.01，蔗糖?30.0，瓊脂18.0，pH為7.0，溶劑為水。