[發(fā)明專利]一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210434709.3
• 申請(qǐng)日: 2012-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN102884984A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳己任;熊興耀;鄧子牛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，尤指一種以2,4-D和TDZ共同誘導(dǎo)中國(guó)月季月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法及該方法在月月紅快速繁殖、基因轉(zhuǎn)化、人工體胚中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic?Embryogenesis)是指在離體培養(yǎng)條件下植物的體細(xì)胞通過與合子胚類似的途徑發(fā)育成新個(gè)體的過程。由于其速度快、數(shù)量大、結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)，利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行喬木樹種的人工種子育苗，可能成為未來人工林苗木來源的一種重要手段；由于體細(xì)胞胚胎往往產(chǎn)生于單個(gè)細(xì)胞，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，有利于獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株；此外,胚性培養(yǎng)物是全能性原生質(zhì)體的重要來源，可用于樹種的遺傳轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞雜交等研究，達(dá)到改良森林樹種的目的。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物界的普遍現(xiàn)象,自1948年Curits等從蘭屬雜種胚愈傷組織中首次發(fā)現(xiàn)和正常胚相似的胚狀體結(jié)構(gòu)以來，已在43科97屬114種植物中有了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道。木本植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究起步較晚，但這個(gè)領(lǐng)域的研究卻取得了令人矚目的進(jìn)展。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)已從挪威云杉、油棕、石刁柏、歐洲七葉樹、胡桃楸、花旗松等樹種中有體細(xì)胞胚胎發(fā)生報(bào)道。月季是世界四大切花之一，也是中國(guó)十大名花之一，其中中國(guó)古老月季月月紅是現(xiàn)代月季的鼻祖，在月季/玫瑰育種中占有非常重要的位置。月季的體細(xì)胞胚胎發(fā)生雖已有報(bào)道，但未見月月紅體胚胎成功的報(bào)道。

本發(fā)明人一直從事月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生和再生研究，發(fā)現(xiàn)通過激素調(diào)控可以誘導(dǎo)月月紅的器官發(fā)生（Organogenesis），直接產(chǎn)生芽，但是誘導(dǎo)率和再生率非常低，未見合子胚類似的體胚發(fā)生。不能形成快速、完整、幼化再生株系，難以通過基因轉(zhuǎn)化途徑改良月季（月月紅）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，是含2,4-D、TDZ、ABA、GA₃和L-脯氨酸的多種培養(yǎng)基在不同光質(zhì)和光強(qiáng)條件下的應(yīng)用，具體地說，就是用上述激素和有機(jī)物組成搭配成不同培養(yǎng)基，在不同光質(zhì)和光強(qiáng)條件下對(duì)月月紅葉柄體細(xì)胞進(jìn)行分階段誘導(dǎo)，最后誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎和再生植株。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用技術(shù)方案是：一種用于月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷誘導(dǎo)方法，該方法是將帶有0.8-1.2mm葉柄的月月紅無菌芽嫩葉置于EP培養(yǎng)基中，在23℃～27℃黑暗培養(yǎng)2-6個(gè)月（一般2個(gè)月就可以獲得愈傷組織，如需獲得更多愈傷組織，可以延長(zhǎng)時(shí)間），得到透明水漬狀或淺棕色的胚性愈傷組織；EP培養(yǎng)基組成：SH培養(yǎng)基+2,4-D3.0mg/L+TDZ1.0mg/L+?L-脯氨酸300.0?mg/L，并加入4.0g/L?瓊脂糖固化培養(yǎng)基，pH值為5.4。在該培養(yǎng)條件下，月月紅的愈傷組織可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，并保護(hù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。?

上述無菌芽是取一年生半木質(zhì)化枝條表面消毒后，置于SP培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月得到；SP培養(yǎng)基組成：MS固體培養(yǎng)基+6-BA2.0mg/L+NAA?0.1mg/L+GA₃3.0mg/L，pH值為6.0，121℃、125?kPa滅菌15min，培養(yǎng)條件：溫度為23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為白光1600Lux，。上述表面消毒是指先用70%體積濃度的酒精消毒30秒，再置于0.3%體積濃度的次氯酸鈉溶液中15分鐘，最后用無菌水清洗3次。

本發(fā)明還提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，該方法是將上述月月紅胚性愈傷組織置于EM培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月，得到兩片子葉為主的體細(xì)胞胚；EM培養(yǎng)基組成：SH培養(yǎng)基+2,4-D1.0mg/L+TDZ0.2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+ABA2.5mg/L+?GA₃3.0mg/L，培養(yǎng)條件：溫度為23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為紅光400Lux。

本發(fā)明另提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎再生植株方法，該方法是將上述月月紅體細(xì)胞胚置于SP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月以產(chǎn)生芽，再按常規(guī)技術(shù)培育出植株；SP2培養(yǎng)基組成：MS固體培養(yǎng)基+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+?GA₃3.0mg/L，培養(yǎng)條件：溫度為23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Lux。

本發(fā)明還提供在月月紅轉(zhuǎn)基因和種質(zhì)改良、創(chuàng)新中的應(yīng)用，以及在月月紅人工種子制作、良種推廣中的應(yīng)用。