[發明專利]一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 201210434096.3
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102888386A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 李來好;岑劍偉;楊賢慶;郝淑賢;劉在軍;吳燕燕;黃卉;魏涯;林婉玲;鄧建朝;周婉君;石紅
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明涉及水產魚類深加工利用的方法，特別是一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法。

背景技術

超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）是一種源自于生物體內的氧自由基清除劑，它能夠維持生物體內超氧陰離子的動態平衡，防止因體內O₂^﹣·濃度過高而引起的不良反應，被譽為“人體垃圾清道夫”，在抗衰老、抗炎癥、抗氧化、抗輻射和防治腫瘤等方面顯示出了獨特的功能，已廣泛應用于食品、醫藥和日用化工等行業。目前，國內外利用陸生動植物（特別是豬、牛、羊血液和大蒜）和微生物開發SOD的研究較多，而有關從水生生物如魚、蝦等中開發SOD的研究甚少，特別是利用羅非魚血液提純SOD的研究未見報道。

中國是世界上最大的羅非魚養殖生產國家，羅非魚加工廠將羅非魚血作為廢物排放，每年向環境中排放的羅非魚血達1.2×10⁴噸。而羅非魚血中富含如超氧化物歧化酶、血紅蛋白等多種有效成分，實現羅非魚血的綜合利用不僅可以避免環境污染，而且能夠顯著地增加企業的附加值，優化企業的產業結構。常見的SOD提純技術有熱變性法、鹽析法、有機溶劑法和層析法等，但是迄今報道的眾多關于不同原材料的SOD提純工藝和參數不盡相同，因此，開發一條適合羅非魚血綜合利用的SOD提純工藝路線顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，從而使這些廢棄羅非魚血液資源得到高值化利用。

為實現上述目的，本發明是通過以下實施方案來實現的：

一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其步驟包括：

a.紅細胞破碎：將收集到的潔凈羅非魚血紅細胞用1~2倍體積的雙蒸水稀釋后，在超聲功率300~400W條件下作用15~20min進行紅細胞破碎處理，然后5000×g離心15min，收集上層紅細胞液；

b.乙醇、氯仿沉淀：先后加入無水乙醇和氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌，攪拌20min后，靜置30min，然后10000×g離心15min，收集上清液；再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿；

c.熱變性處理：將步驟b所得上清液在60℃條件下恒溫水浴15~20min，冷卻后10000×g離心15min，收集上清液；

d.陰離子交換：將步驟c所得上清液在多功能蛋白快速純化液相色譜系統輔助下，采用陰離子交換法，制得SOD液。

本發明還將得到的SOD液用可截留分子量為10KDa的膜系統離心超濾，進行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，并在-20℃條件下封存。

本發明與現有技術相比，具有以下的效果：

（1）本發明首次從羅非魚血液中提純SOD，為羅非魚血液的綜合利用提供了一條有效的途徑，使這些原本廢棄的資源得到高效利用，從而可以大大提高企業的經濟效益，還能帶來莫大的社會效益。

（2）本發明首先是利用超聲技術進行有效的細胞破碎，然后采用乙醇、氯仿沉淀實現SOD與血紅蛋白的同步分離，再利用SOD耐熱性好的特點，通過熱變性處理去除雜蛋白；并使用多功能蛋白快速純化液相色譜系統對陰離子交換過程進行控制，最后用離心超濾進行脫鹽和濃縮后得到SOD；這樣SOD純化過程變得非常簡捷、高效。結果表明，本發明制備的SOD比活力為7541U/mg，回收率為50.8%，純化倍數為1832，經PAGE鑒定為一條帶，達到了電泳純，SOD分子量為32KDa。

（3）本發明工藝過程簡單，生產周期短，條件穩定，適合工業化生產，可向食品、醫藥和日用化工等行業提供價格低廉、安全可靠的SOD產品。

具體實施方式

實例一

取潔凈羅非魚血紅細胞100ml，加入100ml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調至300W，作用15min，5000×g離心15min，收集上層紅細胞液。先后緩慢加入15ml的無水乙醇和10ml的氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌，攪拌15min后，靜置30min，10000×g離心15min，收集上清液，再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。

將上步所得上清液在60℃條件下恒溫水浴15min，迅速冷卻后10000×g離心15min，再次收集上清液。