[發明專利]一種制備生物柴油的方法及其使用的復合酶

無效

• 申請號: 201210433498.1
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102911701A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 李迅;鄧若冰;王飛;李治林;時號
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C10G3/00
• 分類號: C10G3/00;C11C3/10;C10L1/02;C12P7/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于生物酶法制備生物柴油技術領域，尤其涉及利用兩種不同來源的脂肪酶復合協同催化制備生物柴油的方法及其使用的復合酶。

背景技術

化石能源是現代社會賴以生存和發展的物質基礎。隨著全球經濟的快速發展，世界能源的消耗量也越來越大，這使得人們開始意識到緩解能源危機，尋求化石能源的替代品是一件刻不容緩的大事。生物柴油正是這樣一種以動植物油脂為原料，通過酯交換工藝制備而成的可再生清潔燃料，屬于生物質能之一。較傳統石化柴油而言，生物柴油具有良好的燃料性能、較高的安全性能和發動機低溫啟動性能，且潤滑性能好，可延長發動機的使用壽命，是一種真正的綠色能源，廣受世界各國的高度重視。

目前工業上大多使用化學法來生產生物柴油，雖然使用化學法生產的產率較高，但存在醇消耗量大，產物難回收，環境污染大等缺點。與傳統的化學法相比較，利用脂肪酶的酶法制備生物柴油具有反應條件溫和，特異性強，產品易分離、對環境無污染等優勢，已成為目前生物柴油制備技術的主流發展方向。

制備生物柴油的脂肪酶催化特性也存在著差異，南極假絲酵母脂肪酶B（Candida?antarctica?lipase?B，CALB）不存在位置特異性，可以同時作用甘油三酯1,2,3位上的酯鍵，一般情況下，脂肪酶的活性部位被一個螺旋片段（又稱“蓋子”）所包住。由于脂肪酶/水界面的締合作用，出現界面活化現象，酶的構象發生變化，酶活性中心的“蓋子”結構被打開，活性部位得以暴露，使得脂肪酶與底物的結合能力增強，而CALB的一大特性就是，它的活性中心并沒有被“蓋子”埋藏，因此CALB對水溶性和非水溶性物質都表現出較高的催化活性，應用最為廣泛。但是，天然的CALB仍然存在一定的缺陷，如熱穩定性較差、水含量耐受性較差等。

米根霉脂肪酶（Rhizopus?oryzae?lipase，ROL）是一種典型的1,3位特異性脂肪酶，甘油三酯中的2位上酰基只有遷移到1或3位上才能繼續被催化水解為脂肪酸，這是一個自發遷移的過程，水對酰基遷移有促進作用，因此ROL催化的轉酯化反應具有較高的水含量耐受，而且對碳鏈長度為C8-C18的飽和脂肪酸表現出偏愛性。但是，酰基遷移的過程也影響了米根霉脂肪酶的催化效率。

除了用單一脂肪酶直接催化生產生物柴油之外，為了降低生物柴油生產成本，近年來開發出用復合脂肪酶生產生物柴油的新工藝。復合脂肪酶能有效地克服單一脂肪酶的底物專一性，提高酶法制備生物柴油的轉酯化效率，特別在轉酯化能力相當而位置特異性不同的脂肪酶之間表現出較強的協同效應。另外，有些報道指出，酶法制備生物柴油過程中需使用有機溶劑作為反應介質，從而促進甲醇及甘油在反映體系中的溶解，因此，選擇合適的脂肪酶參與協同催化，例如使用具有很好的水含量耐受性的脂肪酶，可以構建一個高產生物柴油的無溶劑催化體系，更加增強了生物酶法的環境友好性。

然而，目前應用在生物柴油制備中的商業化固定化脂肪酶最為廣泛的是諾維信公司的Novozym?435（CALB），由于其高昂的價格，每公斤2270美元，使得它的工業化應用受到限制。因此，自主研發出一種高催化活性的用于生物柴油制備的脂肪酶具有重要意義。

畢赤酵母表達系統能高效表達外源蛋白、蛋白可分泌表達而無需純化，減少生產成本，它所具有的AOX啟動子是一種強有力的啟動子，而且該表達系統由于對營養要求低，培養基成分簡單廉價，可進行高密度高產量的發酵培養，便于工業化生產。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種制備生物柴油的方法，使其在無有機溶劑的環境下，高效快速的制備出生物柴油。本發明的另一目的是提供一種上述方法是用的復合酶。本發明還有一個目的是提供上述復合酶的一種表達載體及重組菌。

技術方案：為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種制備生物柴油的方法：在反應容器中，加入短鏈醇、油脂、水和復合酶，控溫30-50℃，反應48-72h，制得生物柴油；其中，短鏈醇與油脂摩爾比為3~5：1，水的用量為油脂重量的40~100%，復合酶用量為4-22U/g大豆油。

所述的復合酶為南極假絲酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶混配而成的復合酶；其中，南極假絲酵母脂肪酶B為天然酶或重組酶，米根霉脂肪酶為天然酶或重組酶。

所述的南極假絲酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶的酶活配比為：4：32~1。

所述的油脂為植物油脂。