[發(fā)明專利]對水稻褐飛虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210433476.5
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN103060342A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張靈玲;邵恩斯;關(guān)雄;劉斯軍;莊浩瀚;許碧虹;林莉;林立金
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C07K7/06;C12N15/62;C07K19/00;A01P7/04;C12N15/11;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種對植物害蟲具有毒力的毒素和工程菌，具體涉及一種對半翅目水稻褐飛虱高毒力的Bt毒素Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌；屬生物防治技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

水稻是我國最主要的糧食作物，然而水稻的病蟲害繁多，嚴(yán)重影響我國水稻的生產(chǎn)。轉(zhuǎn)Bt基因等抗鱗翅目和鞘翅目害蟲水稻的種植，預(yù)期可有效地防治這類害蟲的危害（Tang?et?al.,?2006;?Wang?et?al.,?2010）。同時(shí)，也不可避免地帶來加重非Bt殺蟲蛋白靶標(biāo)昆蟲刺吸性口器害蟲如飛虱、葉蟬等危害的可能性（Chen?et?al.,?2011）。因此，創(chuàng)制發(fā)展針對稻飛虱等刺吸性害蟲的新型昆蟲毒素迫在眉睫。?

蘇云金桿菌（Bacillus?thuringiensis簡稱?Bt）是世界上應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑。其產(chǎn)生的Cry系列毒素蛋白（δ-Endotoxins）是Bt產(chǎn)生的最重要的毒素蛋白之一，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲及植物病原線蟲的防治（Arenas?et?al.,?2010）。cry基因也是應(yīng)用最廣的用于轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲基因。轉(zhuǎn)cry基因農(nóng)作物（如玉米、棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、番茄、油菜、水稻等）已被大面積種植，有效地控制了鱗翅目與鞘翅目害蟲的危害，成為害蟲管理的一種重要手段（Rie,?2000;?Shelton?et?al.,?2002；Wang?et?al.,?2010）。?

然而，Bt及其所含昆蟲毒素對半翅目及同翅目等刺吸性口器害蟲無明顯毒性，迄今還未發(fā)現(xiàn)對這類害蟲有顯著毒效的Bt株系。鑒于飛虱、葉蟬、蚜蟲等刺吸性害蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大危害及轉(zhuǎn)基因抗蟲品種的種植帶來的加重刺吸性害蟲爆發(fā)性危害的現(xiàn)實(shí)可能性，迫切需要研發(fā)針對此類害蟲的新型抗性基因。以cry基因?yàn)榛A(chǔ)，通過改造Cry毒素分子，開發(fā)能夠產(chǎn)生針對刺吸性害蟲的新型Cry毒素工程菌，是一項(xiàng)具有重大理論和應(yīng)用價(jià)值的研究。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供對半翅目害蟲水稻褐飛虱具有高毒力的Bt毒素Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌。?

以Bt?Cry毒素作用模型?Bravo模型（Knowles,?B.?H.?&?J.?A.?Dow.,?1993）為理論基礎(chǔ)，利用噬菌體短肽文庫展示技術(shù)篩選出可以和水稻褐飛虱中腸結(jié)合的短肽P2S；進(jìn)一步，將短肽序列利用分子片段替換的方法替換Cry分子Domain?Ⅱ的loop2序列，構(gòu)建出cry1Ab-loop2-p2s毒素基因，將該基因與通用表達(dá)載體pGEX-KG（購自GE?Healthcare）連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichia?coli)?BL21-DE3中，經(jīng)過穩(wěn)定性測定、結(jié)合活性測定及毒力測定，獲得了能夠表達(dá)對水稻褐飛虱有高毒性作用Cry1Ab-loop2-P2S毒素的工程菌1Ab-P2S，該菌株為人工構(gòu)建質(zhì)粒的工程菌，宿主為大腸埃希氏菌（Escherichia??Coli），于2012年8月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，菌株保藏號為：CGMCC?NO：6427。?

????所述loop2序列為Cry分子中決定受體識別的環(huán)區(qū)，其氨基酸序列為：RRPFNIGINNQ；所述大腸桿菌BL21-DE3菌株由市場購得。所述噬菌體展示技術(shù)（phage?display）是將基因表達(dá)與親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，其基本原理是將編碼誘餌蛋白的DNA片段插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因進(jìn)行融合表達(dá)，該重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶標(biāo)蛋白庫中與誘餌蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。?

本發(fā)明的技術(shù)方案，操作步驟如下：

1.??????與水稻褐飛虱中腸內(nèi)膜結(jié)合短肽的篩選