[發明專利]草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶及編碼序列

有效

• 申請號: 201210431741.6
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102925417A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 邢少辰;王云鵬;林春晶;韋正乙;馬建;蔡玉紅;劉艷芝;孫卉
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

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技術領域：

本發明公開一種草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及編碼序列，具體是涉及到從土壤宏基因組中分離克隆的一個草甘膦耐受型EPSPS編碼序列和蛋白產物，本發明還涉及此EPSPS的制備和用途，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate?Synthase?(EPSPS)?(EC2.5.1.19)〕是莽草酸途徑的關鍵酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草劑草甘膦是PEP的結構類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，最終導致植物死亡。有些微生物來源的EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，這一途徑是生物產生草甘膦抗性的被動方式。草甘膦作為一種廣譜滅生性、內吸傳導型除草劑，自1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種（任不凡等，1998）。對大多數植物具有滅生性等其它除草劑不可比擬的優點。草甘膦作為一種滅生性除草劑，對農作物同樣具有滅殺作用，這就限制了其使用范圍和使用時間。如果能選育出抗草甘膦或降解草甘膦的農作物新品種，則既能顯著節省農業生產費用，又能極大地促進草甘膦工業的發展。目前，我國尚無進入商品化階段的抗草甘膦轉基因作物，培育我國具有自主知識產權的抗草甘膦轉基因作物具有迫切性。

土壤微生物中蘊藏著極其豐富的基因資源，但由于在絕大多數人為創造的環境中，可培養的細菌數量非常有限，通常低于1％。因此，人們對土壤基因資源寶庫的了解和利用還十分有限。隨著分子生物學技術的發展和微生物學研究手段的進步，宏基因組學為我們研究環境微生物(特別是目前尚不可培養的微生物)提供了手段。通過直接從環境中提取和克隆基因組DNA，理論上可以獲得任何功能的基因序列。直接克隆基因組為我們獲得操縱子或由復雜分子直接合成物質(例如抗生素)提供了機會，本發明提供的編碼EPSPS的基因就是從土壤宏基因組中分離克隆得到的。

目前，國際上使用的抗草甘膦基因主要是美國Monsanto公司從農桿菌CP4中分離的cp4-EPSPS基因。Monsanto公司擁有cp4-EPSPS基因的多項專利，其專利覆蓋了抗草甘膦基因cp4-EPSPS的重要變異位點。本專利公開的抗草甘膦基因不存在Monsanto公司EPSPS基因專利（專利號：US?5804425，200480009843.2）覆蓋的氨基酸的變異位點。

發明內容：

本發明提供一種草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（以下簡稱為EPSPS）多肽及其編碼序列，其編碼的蛋白具有較強的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的活性，并具有良好的草甘膦抗性。

本發明公開的一種5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于：

具有如SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列，或是在SEQ?ID?No.1限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一個或多個氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。

本發明公開的一種編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的編碼序列，其特征在于：

具有如SEQ?ID?No.2所示的多核苷酸序列，具有編碼如SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一個或多個堿基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的編碼序列。

本發明公開一種載體，其特征在于，它含有如SEQ?ID?No.2所述的多核苷酸。

本發明公開一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有如SEQ?ID?No.2所述的多核苷酸的載體。

本發明公開一種具有EPSPS活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含：

（a）在適合的表達條件下，培養含有如SEQ?ID?No.2所述的多核苷酸載體的宿主細胞；

（b）從培養物里分離出具有EPSPS活性的多肽。

本發明公開一種改變植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）攜帶如SEQ?ID?No.2所述的多核苷酸的載體的農桿菌；

（2）利用步驟（1）所述的農桿菌侵染植物的細胞，組織或者器官；