[發明專利]一種快速檢測鴨出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法

無效

• 申請號: 201210428152.2
• 申請日: 2012-10-31
• 公開（公告）號: CN102876815A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 鄒敏;吳發興;劉新文;胡瀟;范根成;杜元釗
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

1.一種快速檢測鴨出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法，其特征在于該方法為：

（1）用常規病毒核酸提取方法提取疑似鴨出血性卵巢炎病例的肝臟、卵巢組織樣品中的可能含有的DHOV總RNA；

（2）RT（反轉錄）反應20μL體系，各組分包括DHOV總RNA?3μL、AFVTR1μL、5×反轉錄Buffer?4μL、含Mg2+的dNTP?4μL、RNA酶抑制劑0.5μL、反轉錄酶0.5μL，最后用滅菌雙蒸水或滅菌DEPC水補足反應體積至20μL，瞬時離心后室溫平衡5~10min，在42℃保溫1.5h，即可獲得用于PCR擴增的cDNA；

（3）PCR（聚合酶鏈式擴增）擴增反應25μL體系，各組分包括10×PCR?Buffer2.5μL、含Mg2+的dNTP?2μL、引物AFVTF和AFVTR各0.5μL、rTaq酶0.5μL、cDNA?3μL、加滅菌雙蒸水至25μL。反應程序為95℃變性5min，32×（94℃45s、55℃45s，72℃50s）個循環反應，最后72℃延伸10min；其中AFVTF和AFVTR是針對黃病毒基因組E基因設計的一對引物，這對引物的序列為

AFVTF：5'-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3'

AFVTR：5'-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3′；

（4）電泳檢測??PCR反應結束后，取5~10μL擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠，在100V、45~60min條件下進行電泳，進行觀察、照相和記錄結果。