[發明專利]一種生枝霉素的工業高效液相色譜精制方法

無效

• 申請號: 201210426740.2
• 申請日: 2012-10-31
• 公開（公告）號: CN103788158A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王亞輝;李楠;初新
• 申請（專利權）人: 江蘇漢邦科技有限公司
• 主分類號: C07H17/08
• 分類號: C07H17/08;C07H1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于天然產物提取領域，具體涉及一種生枝霉素的制備方法。

背景技術

枯草芽孢桿菌代謝產物中的活性物質主要是抗菌肽和活性蛋白類物質，其分離純化方法很多。呂樹娟等人采用陰離子交換柱DEAE-Sepharose?FF、疏水柱SOURCE?15?PHE、分子篩柱Sephacry1?S-200HR和反相C18柱對Bacillus?subtilis?JA-206粗提液多步分離純化后得到三種抗菌肽。易有金等人采用了硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose?FF柱層析、FPLC?Phenyl?FF疏水色譜柱、HPLC?C18反相色譜柱的方法，從枯草芽孢桿菌B-001的代謝產物中分離得到一種抗菌蛋白，該純化的抑菌蛋白對青枯病菌有強烈的抑制作用。

生枝霉素是十六元環大環內酯類抗生素，對革蘭氏陽性菌，部分陰性菌及厭氧菌有良好的抗菌作用，對臨床耐紅霉素的金葡球菌僅有極少交叉耐藥性，其小鼠體內活性優于臨床上常用的紅霉素和乙酰螺旋霉素，從枯草芽孢桿菌的發酵液中，分離出高純度的生枝霉素，至今尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用工業制備級液相色譜分離系統制備高純度生枝霉素的方法，該方法包括以下步驟：

a.?將枯草芽孢桿菌發酵液用HCl調節pH?至2，靜止于4℃環境下，離心收集沉淀，加甲醇溶解得抗菌粗提物；

b.采用HPLC優化生枝霉素的最佳分離洗脫條件，將其等比例放大，應用在填充十八烷基反相硅膠填料的動態軸向壓縮柱上進行分離，在線收集生枝霉素對應譜帶的餾分；

c.將步驟b中收集的對應譜帶洗脫液減壓干燥，即可得到色譜純為99%的生枝霉素。

本發明的有益效果是直接采用枯草芽孢桿菌發酵液提取后的抗菌粗提物來制備生枝霉素，不需要大量的前處理過程，簡單、易控制，工藝技術簡化，適用于大規模制備。高效液相色譜測定中，總雜質峰小于0.5%，純度大于99.5%，完全可用于食品和藥物的開發。

具體實施方式

實施例1

1.?將枯草芽孢桿菌發酵液用HCl調節pH?至2，靜止于4℃環境下12?h，?5000?rpm離心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；

2.將抗菌粗提物溶液注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ50×250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10μm，上樣量5ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相乙腈與水體積比范圍為70/30~85/15，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在12~16.5min的餾分，經HPLC分析純度≥99.5%。

實施例2

1.?將枯草芽孢桿菌發酵液用HCl調節pH?至2，靜止于4℃環境下24?h，?10000?rpm離心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；

2.將抗菌粗提物溶液注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ50×250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10μm，上樣量8ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相乙腈與水體積比范圍為75/25~85/15，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在10~16min的餾分，經HPLC分析純度≥99.5%。

實施例3

1.?將枯草芽孢桿菌發酵液用HCl調節pH?至2，靜止于4℃環境下24?h，?10000?rpm離心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；

2.將抗菌粗提物溶液注入動態軸向壓縮柱制備色譜系統，動態軸向壓縮柱尺寸為Φ50×250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10μm，上樣量10ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70~70/30，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質沖洗出來，一個分離周期結束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在12.5?~20min的餾分，經HPLC分析純度≥99.5%。