[發明專利]綠豆過敏原抗體及其制備方法與應用無效
| 申請號： | 201210425604.1 | 申請日： | 2012-10-31 |
| 公開（公告）號： | CN103792363A | 公開（公告）日： | 2014-05-14 |
| 發明（設計）人： | 王碩;張燕;生威;王俊平;張潔瓊 | 申請（專利權）人： | 天津科技大學 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N33/531 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 300222 天*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 綠豆 過敏原 抗體 及其 制備 方法 應用 | ||
1.綠豆過敏原多克隆抗體使用綠豆過敏原蛋白作為免疫原免疫兔子和小鼠進行制備。
2.權利要求1所述的綠豆過敏原蛋白兔多抗的制備方法，其特征在于使用下述步驟制得：
初次免疫：取1mg純化的綠豆過敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，采用皮下和肌肉注免疫雌性大白兔；
加強免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月，第五次免疫完后7-10天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測進行動物免疫；
抗體純化：定時監測動物抗體效價，當抗體對綠豆過敏原蛋白的效價達到1∶150000時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B免疫層析親利柱對抗血清進行純化，得到純化的兔抗多克隆抗體。
3.權利要求1所述的綠豆過敏原蛋白鼠多抗的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：
免疫：免疫動物選用，，。潔凈等級：SPF級。注射方式；免疫周期：
初次免疫：取0.1mg上述純化的綠豆過敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，采用腹腔注射免疫7-8周大BALB/c雌性小鼠；
加強免疫：取0.1mg上述純化的過敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液中，在除免后進行加強免疫，此后每兩周一免，免疫四次；最后一次免疫七天后對小鼠摘眼球取全血；
抗體純化：定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清。
4.權利要求1所述的綠豆蛋白過敏原和抗體在免疫檢測方法中的應用，其特征在于方法如下：
(1)包被：純化后的兔抗綠豆蛋白抗體經包被液稀釋，然后以100μL/well包被于酶標板上。4℃孵育12-16小時后棄去孔中液體，用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。
(2)封閉：在酶標板中加入200μL/well封閉液，室溫封閉1小時后棄去封閉液，用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。
(3)加樣：加入梯度稀釋的綠豆蛋白溶液，100μL/well。室溫孵育1小時后棄去孔中液體，用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。
(4)加鼠抗血清：將鼠抗綠豆蛋白血清用PBS稀釋，加入酶標板中100μL/well，室溫孵育1小時，然后用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。
(5)加酶標二抗：加入PBS稀釋10000倍的HRP標記的羊抗鼠二抗，100μL/well，室溫反應30分鐘后用PBST洗液洗板5次，每次2分鐘。?
(6)顯色：提前15分鐘配制好底物溶液，每孔中加入100μL，室溫暗處顯色20分鐘。
(7)終止：在每孔中加50uL終止液。
(8)讀數：在雙波長方式(450-650nm)下用酶標儀讀取吸光度值(OD值)。?
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