[發明專利]杏仁過敏原蛋白amandin的制備方法

無效

• 申請號: 201210425588.6
• 申請日: 2012-10-31
• 公開（公告）號: CN103788188A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王碩;張燕;王俊平;張潔瓊;談超;生威
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于食品過敏原免疫化學和檢測分析技術領域；涉及分離純化，免疫化學，生物化學及物化測試技術等；特別涉及杏仁過敏原蛋白的提取純化和免疫動物特異性抗體的制備及其免疫分析方法的建立。

背景技術

食物過敏是人們對食物產生的一種不良反應，屬機體對外源物質產生的一種變態反應，已經成為一個全球性的食品安全問題。流行病學調查表明全球范圍內有1％～2％的成年人對食物過敏，而小于3歲的嬰幼兒中有8％以上對食物過敏。另一項調查則顯示食物過敏反應對5％的兒童和3％～4％的成年人產生危害，并且患病率呈逐年增加的趨勢。食物過敏是誘導皮膚疾病、腸道及呼吸道等多種癥狀的重要原因。

樹堅果是世界各國公認的八大主要食品過敏原之一，根據美國FDA資料統計，在美國所有過敏反應中，由花生和樹堅果引起的過敏占10％～47％。杏仁是世界范圍最受歡迎的樹堅果類之一，在樹堅果類產品中產量排名第一。據美國統計，堅果(包括杏仁、核桃等)、鳳梨和花生這幾類過敏原大約影響美國總人口的1.1％，其中對花生過敏的人數最多，占總數的30％，而對杏仁過敏的患者也占總數的10％以上。

蛋白質是生物體內最復雜，也是最重要的物質之一。食品過敏原的產生與蛋白質密不可分，環境中能夠成為過敏原的物質都含有蛋白質，可以延伸地認為：任何含有蛋白質的食物對于某些敏感性人群來說都可能是潛在的過敏反應激發源。已知結構的過敏原都是蛋白質或糖蛋白，分子量從3kDa到90kDa，大部分在10kDa到40kDa之間。

杏仁中含有大約188種蛋白，Amandin是一種水溶性蛋白，將濃度較高的脫脂杏仁粉水提液，長時間(12-14h)置于4℃左右，amandin可以析出，利用這一原理可以提純杏仁過敏原蛋白沉淀法簡單，且純度較高。

發明內容

需要解決的問題：

本發明的目的是提取純化的杏仁過敏原amandin；獨特之處在于提取純化amandin的方法簡單，且純度較高，可用于免疫動物誘導產生親合性很高的特異性抗體。

技術方案：

本發明提供了一種簡單有效地提取杏仁中過敏原amandin的方法，可以用于免疫動物制備針對amandin的特異性抗體，抗體的特異性取決于amandin的純度。該技術研究的關鍵是冷沉淀法對杏仁中過敏原amandin的提取

根據amandin的物理化學性質，提出利用以冷沉淀的方法對杏仁中過敏原amandin提取純化，取脫脂杏仁粉，用含0.02％NaN₃的雙蒸水，以1∶30(w/v)提取杏仁粉中的杏仁蛋白，搖床200rpm，室溫提取1h，將混合物6000g離心10min，得到的沉淀物重復上述提取過程，收集兩次離心的上清液，過0.45μm纖維素膜，4℃保存12-14h，上述液體中會出現白色絮狀物冷沉淀下來，該白色沉淀中就含有杏仁過敏原蛋白amandin。4℃，12000g，離心上述液體20min，得到的白色沉淀就是含有目的蛋白amandin。這期間，沒有涉及到任何復雜的化學試劑與操作步驟。

有益效果：

與其他同類方法相比，本發明具有準確、快速、方便、廉價等特點。該方法提取的杏仁過敏原純度高，，為制備特異性良好的抗體奠定了基礎。

具體實施方式

實施例1：

1.脫脂杏仁粉的制備

將杏仁、正己烷以1∶10(w/v)，搖床250rpm，室溫下脫脂3h后，抽濾，棄去有機溶劑，將上面得到的沉淀按照上述過程重復抽濾一次。抽濾，棄掉有機溶劑。將沉淀置于通風櫥過夜，揮發殘留的正己烷，研缽研磨，分別得到苦杏仁和甜杏仁的脫脂杏仁粉，-20℃保存。

2.提取純化的杏仁過敏原蛋白amandin

取脫脂杏仁粉，用含0.02％NaN₃的雙蒸水，以1∶30(w/v)提取杏仁粉中的杏仁蛋白，搖床200rpm，室溫提取1h，將混合物6000g離心10min，得到的沉淀物重復上述提取過程，收集兩次離心的上清液，過0.45μm纖維素膜，4℃保存12-14h，上述液體中會出現白色絮狀物冷沉淀下來，該白色沉淀中就含有杏仁過敏原蛋白amandin。4℃，12000g，離心上述液體20min，得到的白色沉淀就含有目的蛋白amandin，將沉淀溶于PBS(pH7.4)中，雙蒸水室溫透析9h，每3h一換水，最后取出凍干成粉，存在-20℃。

連接電泳儀與電泳槽，打開電源，將電壓調至80V，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊1cm-1.5cm處，停止電泳。

電泳結束后，切斷電源，從電泳槽中取出凝膠板，用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板，在凝膠切下一角作為加樣標志，然后將凝膠放入考馬斯亮藍R-250染色液中，置于搖床上室溫下染色過夜。次日用脫色液脫色，至蛋白條帶清晰。電泳的條帶集中20-22KDa，42-46KDa，這與文獻中的結果吻和，且幾乎沒有雜蛋白。