[發明專利]一種抗除草劑伏草隆的特異性抗體

有效

• 申請號: 201210425571.0
• 申請日: 2012-10-31
• 公開（公告）號: CN103788208A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王碩;張燕;王俊平;生威;徐欣
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/107;C07K16/44;C07K16/06;C07C275/30;C07C273/18;C07D207/46
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 孫春玲

技術領域

本發明涉及選擇一種最大可能包含伏草隆征結構的化合物作為伏草隆半抗原，并將半抗原制成抗原、進而產生抗體；以及此類半抗原、抗原的合成與抗體制備方法。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

除草劑是近20年來逐漸發展起來的一種農藥類型，隨著化學工業的發展，除草劑的品種也逐漸增多。在我國研制和投產的除草劑也已達數十種。有些除草劑具有致畸作用，除草劑的安全性已經引起人們的關注，應注意除草劑對環境的污染和人畜毒性作用問題。使用除草劑能在糧食等中殘留，通過食物鏈而使人畜發生慢性危害作用。我國國家標準《食品中伏草隆最大殘留限量標準》(GB16323-1996)規定伏草隆最大殘留限量為：玉米≤0.05mg/kg、甘蔗≤0.05mg/kg，是食品必須檢測的安全指標，一般傳統上采用氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)或氣相色譜質譜法聯用等物化方法對其殘留進行檢測。雖然這些傳統的理化分析方法靈敏度較高，而且較為準確，但由于它們普遍操作繁瑣復雜、成本較高、分析速度慢，所以難于滿足實際分析的需要，因此迫切需要發展一種簡單、快速、靈敏的分析技術。免疫分析技術是一種快速、靈敏、操作簡單、費用低的檢測技術，開發伏草隆的免疫分析方法是滿足當前食品安全檢測的需求的重要技術途徑。

發明內容

本發明設計合成了小分子目標分析物半抗原，并與載體蛋白質偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應，從而定性定量測定伏草隆的量。伏草隆由于其分子量小于1000dolton(道爾頓)，不具備免疫原性，不能直接免疫動物獲得抗體，因此本發明為達到以上目的所設計的技術方案是。

需要解決的問題：

針對上述情況，當前急需一種簡易快速有效地檢測伏草隆的方法。本發明的目的是通過制備伏草隆的人工抗原，免疫動物誘導產生親合性很高的特異性抗體；并以此為基礎建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，準確檢測杏仁伏草隆。

技術方案

1.使用分子式為

的半抗原與牛血清白蛋白連接合成人工抗原，與辣根過氧化物酶連接合成酶標抗原，其中人工抗原再經過免疫新西蘭大耳兔，取血，分離出抗血清純化制得抗體；

2.除草劑伏草隆人工抗原的制備步驟

(1)N-甲基丁酸、N-甲基已酸的合成

在100mL燒瓶中加入27.5mL雙蒸水，4mL(4.064g)N-甲基吡咯烷酮和5.7gBa(OH)₂·8H₂O，在電熱套上加熱回流狀態下反應3h。反應完成后在4℃靜置12h后用濾紙過濾除去析出的白色Ba(OH)₂，在旋轉蒸發儀上蒸干濾液，得到粗品N-甲基丁酸。粗品在熱水浴中用無水乙醇-乙醚(V_無水乙醇∶V_乙醚＝1∶1)溶解后，過濾，冷卻結晶得到白色針狀結晶物為N-甲基丁酸。

在100mL燒瓶中加入46.8mL雙蒸水，5.416mL(1.340g)N-甲基己內酰胺和2.884mL濃H₂SO₄，在加熱回流10h后于攪拌狀態下趁熱加入Ba(OH)₂固體，調節pH值達到10，在冰箱靜置24h后過濾除去白色BaSO₄沉淀，并用少量蒸餾水清洗，洗液并入濾液中，在旋轉蒸發儀上蒸干濾液，得到粗品N-甲基己酸(二水合物)。粗品在熱水浴中無水乙醇/乙醚(V_無水乙醇∶V_乙醚＝1∶1)溶解，過濾，重結晶兩次，得到白色針狀結晶物為N-甲基已酸。

(2)半抗原的合成

取2.0mmoLN-甲基丁酸(N-甲基已酸)和2.0mmoL3-(三氟甲基)異氰酸苯酯溶解于4.2mL1mol/LNaOH溶液中，攪拌反應2h后過濾，棄沉淀物。用濃鹽酸調濾液的pH至2，此時溶液呈乳白色，靜置過夜，待固體粗品析出后棄去上層水溶液。粗品先經薄層色譜(TLC)鑒定(其中展開劑為：正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸＝49∶49∶2)有無新點出現，若有新物質產生再經質譜鑒定產物分子量。用乙醇/水(V_無水乙醇∶V_水＝1∶2)對粗品重結晶兩次。