[發明專利]一種基于位點特異性重組的RNA干擾載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210424785.6
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN103060374A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 常惠蕓;馬延濱;叢國正;高閃電;獨軍政;邵軍軍;林彤;郝春霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

1.一種基于位點特異性重組的RNA干擾載體，其特征在于所述的干擾載體依次包括以下相連的各部分：與豬的整合素受體β3基因上某單一內含子區域上游進行同源重組的同源重組臂1、人U6啟動子序列、多克隆酶切位點、人U6終止子序列、含有PCMV啟動子的新霉素抗性基因、與豬的整合素受體β3基因上某單一內含子區域下游進行同源重組的同源重組臂2、復制起始位點基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點，所述的豬的整合素受體β3基因的GeneBank登錄號為NC_010454.3。

2.如權利要求1所述的RNA干擾載體，其特征在于所述的與豬的整合素受體β3基因上某單一內含子區域上游進行同源重組的同源重組臂1是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴增得到的：

引物F:5’-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’

引物R：5’-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3’；

所述的與豬的整合素受體β3基因上某單一內含子區域下游進行同源重組的同源重組臂2是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴增得到的：

引物F：5’-GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’

引物R：5’-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3’。

3.如權利要求1或2所述的RNA干擾載體，其特征在于所述的載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

4.一種構建權利要求1-3任一項所述的RNA干擾載體的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）同源臂的構建

以提取自豬肝組織的DNA為模板，設計兩對引物分別用來擴增同源重組所使用的同源重組臂1以及同源重組臂2：

擴增同源重組臂1所用的引物為

F:5’-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’

R：5’-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3’；

同源重組臂2所用的引物為

F：5’-GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’

R：5’-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3’。

克隆得到的片段分別連接到PMD20-T載體上，得到分別連有同源重組臂1和同源重組臂2的重組載體PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2；

（2）人U6啟動子、多克隆酶切位點、人U6終止子序列的構建

以含人U6啟動子、多克隆酶切位點、人U6終止子序列的載體為模板，PCR擴增得到含有人U6啟動子、多克隆酶切位點、人U6終止子序列的片段，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構建得到PMD20-T-U6；

（3）正篩選基因的構建

新霉素抗性基因NEO以及PCMV啟動子以載體PGT-V1為模板進行克隆，NEO的擴增引物為：

F:5’-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’

R：5’-TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’；

PCMV啟動子的擴增引物為：

F:5’-ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’

R：5’-GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC?AC-3’；

（4）骨架載體的構建

合成多克隆位點，并將其亞克隆到pUC57載體上，構建骨架載體pUC57-MCS，多克隆位點序列如SEQ?ID?NO.2所示；

（5）元件組裝

①利用PMD20-T-HA2載體上的SpeI與BamHI位點酶切后，將同源重組臂2連接到骨架載體pUC57-MCS上，構建成為載體pUC57-2；

②PCMV與NEO基因的組裝：將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點將兩個基因拼接成為PCMV-NEO，將PCMV-NEO克隆到載體pUC57-2上，構建成為載體pUC57-N2；

③利用PMD20-T-U6上的AgeI與SalI以及PMD20-T-HA1上的XmaI與SalI位點，將HA1克隆到PMD20-T-U6上，構建成PMD20-T-HA1-U6；利用PMD20-T-HA1-U6上的SalI與ClaI位點將目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，構建成為目的載體PSN-U6。