[發(fā)明專利]冬蟲夏草中國被毛孢合成乙酸的酶、基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210424658.6
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN103074311A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 鄭裕國;柳志強;吳暉;李邦良;許靜;林善;許峰;薛亞平;袁水金;王鴻艷
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P7/54
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發(fā)明涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與乙酰輔酶A出發(fā)合成代謝乙酰基-酰基載體蛋白的脂肪-酰基輔酶A合酶（Acyl-coenzyme?A?synthetase），編碼這個酶的基因及其應用，乙酰基-酰基載體蛋白可再經(jīng)過水解生成乙酸。

（二）背景技術

冬蟲夏草（Cordyceps?sinensis?(Berk.)?Sacc.）是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus?armoricanus?Oberthur）幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領域展現(xiàn)出巨大的應用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢子階段（有性型）。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液,是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提高。

近年來，隨著天然產(chǎn)物化學和現(xiàn)代色譜技術的飛速發(fā)展，在對蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國內外已對蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、甾醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。

不飽和脂肪酸是指分子中含有一個或多個雙鍵的脂肪酸，其熔點較飽和脂肪酸低。不飽和脂肪酸是構成體內脂肪的一種脂肪酸，人體必需的脂肪酸，不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸二種。多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated?Fatty?Acids，PUFAs）相對飽和脂肪酸來說具有更多的功效，它可以降低血中膽固醇和甘油三酯，調節(jié)心臟功能，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞的活性，增強記憶力和思維能力，增強人體防御系統(tǒng)的功能等，此外它還可以排除人體內多余的“垃圾”，也就是由于攝人了過量的飽和脂肪酸形成的多余脂肪，從而達到減肥的目的。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價值受到了世界的廣泛關注，引起了食品、醫(yī)藥甚至化妝品等行業(yè)的高度重視。

1999年Yung-Sheng引克隆了高山被孢霉（Mortiere?Uaalpina）的△6和△12脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進行了表達。2004年，Dyer等人將桐樹中的△3去飽和酶轉入酵母，成功地獲得了產(chǎn)亞麻酸的酵母菌。2007年Maali-Amiri等人將藻青菌（Cyanobacterium）的△12去飽和酶轉入馬鈴薯，成功檢測到馬鈴薯脂肪酸成分發(fā)生了明顯變化。2008年，Hao等人將卷枝毛霉的△6去飽和酶轉人轉基因煙草中，成功獲得了高產(chǎn)γ-亞麻酸的菌株。此外，還有許多脂肪酸去飽和酶相關的基因被克隆并轉化應用。由于大部分去飽和酶為膜結合蛋白，其分離純化十分困難，已經(jīng)分離純化并鑒定的去飽和酶屈指可數(shù)，而絕大多數(shù)的研究是圍繞去飽和酶基因及其表達調控來進行的。