[發明專利]一種檢測口蹄疫病毒的RT-HDA試劑盒及引物

有效

• 申請號: 201210420865.4
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102912039A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 蒲靜;喬彩霞;張偉;高志強;劉環;汪琳;谷強;張鶴曉
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及一種檢測口蹄疫病毒的RT-HDA試劑盒及引物，屬于檢驗檢疫領域。

背景技術

口蹄疫（Foot-and-mouth?disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth?disease?virus，FMDV）引起的急性熱性高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄獸，患病動物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發生水泡，破潰形成爛斑。人和非偶蹄動物也可感染本病，但癥狀較輕。由于豬、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成全球大規模流行，所以世界動物衛生組織（OIE）和聯合國糧農組織（FAO）將該病列為A類動物傳染病。在我國，口蹄疫被列為一類動物傳染病。歷史上口蹄疫的暴發給世界畜牧業生產造成巨大的經濟損失，也嚴重的影響了社會政治、經濟的穩定發展，是名副其實的“世界政治經濟病”。口蹄疫在世界的分布也很廣，可在國際間相互傳播形成世界范圍內的大流行。至今幾乎世界上所有的國家或地區歷史上都曾經發生過口蹄疫。在17～19世紀，歐洲大陸曾多次發生和廣泛流行本病。到20世紀80年代，大洋洲、北美洲已無口蹄疫疫情，歐洲國家的疫情也大大減少，而亞洲、非洲和南美洲各國則是口蹄疫的重疫區。近年來，口蹄疫在世界上主要流行于亞洲，其次是非洲、南美洲和歐洲。口蹄疫在我國流行歷史由來已久，其特點是在一定地區一定時間接連不斷發生。而且我國毗鄰的很多周邊國家和地區多為口蹄疫流行疫區，疫病呈周期性暴發，且反復不斷。這些因素對我國造成嚴重威脅，發生口蹄疫大流行的可能性非常大。歷年來我國政府和地方各防疫機構都非常關注口蹄疫的疫情動態，并高度重視口蹄疫的防制工作。隨著加入WTO，我國從其他國家進口牛肉和豬肉等產品的批次和數量都急劇上升，所有這些都要求我們能夠提高檢驗檢疫技術水平，力促外貿工作的順利進行并保證人畜及生產的安全。

口蹄疫病毒具有型多易變的特點，目前有7個血清主型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亞洲Ⅰ型。每一主型又分若干亞型，迄今為止已發現的亞型有65個，且仍可能在不同的地區出現新的變異株和新的亞型。我國口蹄疫的病毒型主要為O、A型和亞洲Ⅰ型。動物感染一種血清型的病毒后，不產生對其他型的免疫力，但同型的亞型之間有部分的交叉反應。目前口蹄疫的檢測技術主要有病毒分離技術（包括細胞培養和動物接種兩種方法）、血清學檢測技術（包括病毒中和試驗、間接血凝試驗、乳膠凝集試驗、免疫擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光抗體試驗、免疫熒光電子顯微鏡技術等）和分子生物學技術（包括聚合酶鏈式反應、核酸探針、核酸序列分析、電聚焦寡核苷酸指紋圖譜法、基因芯片技術等）。實際檢測中，對肉類食品中低含量的FMD病毒、隱性感染或持續帶毒宿主進行檢測的方法必須具備高敏感性、高特異性和高準確性，但傳統的診斷方法不能滿足這一要求。常規的PCR技術雖然提高了檢測的靈敏度和特異性，但也有費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數量少等缺點。近幾年發展起來的實時熒光定量RT-PCR將PCR與熒光檢測相結合，具有操作簡便、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優點，已逐漸成為病原體檢測的重要方法。但是，熒光PCR儀造價不菲，儀器和試劑檢測成本過高使得這一檢測技術始終局限于條件比較好的實驗室中，難以在基層推廣應用。

近年來，分子診斷技術日新月異，產生了多種新型分子擴增技術，推動著分子診斷技術向操作簡單、儀器設備要求不高的方向發展。其中，依賴解旋酶恒溫基因擴增技術（Helicase-Dependent?Isothermal?Amplification，HDA）是2004年BioHelix的研究人員模擬動物體內DNA的復制機制發明的一種新的體外恒溫擴增技術。該技術利用DNA雙鏈解旋酶打開雙鏈DNA，同時在單鏈結合蛋白（SSB）和DNA聚合酶的作用下，擴增靶片段，實現目的基因的體外擴增。HDA技術與其他基因擴增技術比較，具有如下優勢：

1.與PCR技術相比，HDA技術模仿自然界DNA合成方式，憑借DNA解旋酶解開雙鏈并完成擴增，而傳統PCR是通過變性-退火-延伸過程的多次循環實現。由于原理的不同，使得HDA的優點尤其突出：①HDA反應在同一溫度下進行，因而不需要昂貴的PCR儀，有利于在基層實驗室推廣應用。②由于只用一種溫度擴增使得HDA反應時間明顯縮短，僅需1h左右。③HDA技術采用去除了5’-3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，該酶兼具耐高溫性、高效擴增反應性、極好的條帶均一性及高準確性等特點，不易引起非特異性擴增，使得HDA技術具有更高的特異性和敏感性。