[發明專利]重組桿狀病毒感染家蠶的一種新方法

無效

• 申請號: 201210420392.8
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102885011A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 楊銳;沈運旺;吳小鋒
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01K67/04
• 分類號: A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 陳昱彤

技術領域

本發明涉及重組病毒感染技術，尤其涉及一種重組病毒感染家蠶的方法。

背景技術

昆蟲桿狀病毒表達載體系統（BacuLovirus?Expression?Vector?System,簡稱BEVS）是利用攜帶有外源目的基因的重組昆蟲桿狀病毒作載體在昆蟲體內或昆蟲培養細胞進行表達生產的一個重組蛋白生產系統。由于該系統具有可以利用昆蟲個體或其培養細胞進行大規模的高效表達生產等優點而成為目前最有效的真核表達系統之一。目前BEVS主要包括歐美國家正在廣泛應用的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa?californica?nucleopolyhedrosis?virus，簡稱AcNPV)?和在中國、日本應用較多的的家蠶核型多角體病毒（Bombyx?mori?nucleopolyhedrosis?virus,?簡稱BmNPV）兩類表達系統（Smith?et?al.,?1983;?Maeda?et?al.,?1984,?1985）。家蠶BmNPV表達系統由于可以利用我國飼養量最大的經濟昆蟲－家蠶作為表達載體，從而具有成本低、適合規模化生產的優點，非常具有我國特色（呂鴻聲，?1998）。然而，目前的感染技術都是采用將重組病毒直接注射入家蠶體內的方法進行感染表達，在實際操作過程中由于需要逐條家蠶進行注射，花費時間長，操作繁瑣，而且由于家蠶在注射過程中由于蟲體蠕動等原因，造成病毒液流出體外，最終導致感染失敗，因此目前傳統的經皮注射方法缺陷明顯，工作效率低下。為了提高桿狀病毒表達系統的工作效率，有必要開發出更加高效的感染方式。通過反復試驗，我們發現將病毒液涂于家蠶幼蟲體表，也能實現病毒進入蟲體，最終導致病毒的感染，達到與經皮注射感染一樣的效果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組桿狀病毒經皮感染家蠶的新方法。

為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

本發明重組家蠶桿狀病毒經皮感染家蠶的方法是：將家蠶幼蟲集中于飼養框內；以100頭家蠶幼蟲噴射5ml重組家蠶桿狀病毒液為標準，將含有10^6?pfu的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表；噴射后1小時內不飼喂桑葉，待大部分病毒液干燥后，按照常規方法飼養家蠶幼蟲，直至家蠶幼蟲出現病毒感染癥狀。

進一步地，本發明所述家蠶幼蟲為3齡或4齡。

?與現有技術相比，本發明具有的有益效果是：

????（1）本發明方法實施的結果表明，通過將重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表，也能使病毒進入家蠶體內；由于家蠶與其他昆蟲一樣，有一個開放式的血液循環系統，一旦病毒進入血液，病毒就能夠很快感染，并向周圍組織擴散，最終實現全身感染。?

????（2）家蠶-桿狀病毒表達系統有可能成為我國生物技術產業化中的一個有力工具，本發明較好地解決了重組病毒感染操作繁瑣、效率低下的問題，簡化了病毒感染方法，大大提高了桿狀病毒表達系統的工作效率。

附圖說明

（1）圖1是家蠶幼蟲的血液樣品在熒光倒置顯微鏡下觀察的照片，其中，圖1（a）為無感染的家蠶幼蟲的血液樣品；圖1（b）為被重組家蠶桿狀病毒感染后的家蠶幼蟲的血液樣品，且出現綠色熒光。

（2）圖2是無感染家蠶幼蟲與被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲的癥狀對照圖，其中，圖2（a）為無感染家蠶幼蟲；圖2（b）為被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲。

具體實施方式

以下進一步詳細介紹本發明方法：

1．材料：重組家蠶桿狀病毒采用目前已經非常成熟的技術構建，具體方法可以參見國內外發表的論文，如2006年發表在《蠶業科學》的“利用細菌轉座子構建適用于家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達系統”一文，32（2）：183-188。利用上述家蠶的Bac-to-Bac技術構建一個表達報告基因綠色熒光蛋白EGFP的重組家蠶桿狀病毒，利用該病毒，使用本發明方法經皮感染家蠶幼蟲。

在以下實施例中，使用家蠶雜交種，品種名稱為秋豐×白玉，家蠶幼蟲以桑葉飼養，飼養溫度為23～25℃。?

在以下實施例中，重組家蠶桿狀病毒經皮感染家蠶的方法如下：

????將家蠶3齡或4齡幼蟲集中于飼養框內；以100頭家蠶噴射5ml病毒液為標準，用小型噴霧器將含有10^6?pfu（病毒感染單位）的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表，并在噴射后1小時內不飼喂桑葉；之后在大部分或全部病毒液體干燥后，按照常規方法飼養家蠶，直至家蠶幼蟲出現圖2（b）所示的病毒感染癥狀。