[發明專利]一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗

無效

• 申請號: 201210418808.2
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102988973A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 周井祥;王好;李新偉;張東鳴;朱霞;祖岫杰
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61K48/00;A61P31/22
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，屬生物技術領域。

背景技術

錦鯉皰疹病毒病(Kio?herpesvirus?disease,KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(Kio?herpesvirus,KHV)引起錦鯉、鯉魚及其普通變種如框鏡鯉等發病的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。

該病于1998年首次在以色列的Magan?Michael地區和美國爆發，2000年該病傳至英國、德國和比利時；2002年4月，印尼發生本病，同時中國廣東省錦鯉疑似發生本病；同年12月我國臺灣省證實錦鯉感染本病；2003年10月日本證實該病已在本國存在。目前，該病在我國的鯉魚養殖中發病較多，造成鯉魚的大量死亡，給鯉魚養殖業帶來了幾乎毀滅般的打擊。盡管有多種傳統疫苗可用于疾病的免疫預防，但在生產實踐中以及我們的試驗研究結果均表明，利用滅活苗來免疫預防錦鯉皰疹病毒病不能起到完全免疫保護作用，同時在我國尚未見有分離出或研究出KHV弱毒株病毒的報道，因此亟待有該病毒的新型疫苗問世。

核酸疫苗(Nucleic?acid?vaccine)又稱基因疫苗、DNA疫苗，它是利用DNA重組技術將保護性抗原蛋白基因克隆到真核表達載體，并將其直接導入體內，使抗原蛋白內源性表達遞呈給免疫系統，誘發機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。ORF81基因表達主要囊膜蛋白，是KHV囊膜的重要組成部分，可構成病毒主要抗原決定簇；其功能與誘導病毒與細胞融合、病毒對細胞的吸附和穿入以及在細胞核膜出放有關。本專利以ORF81基因為目的基因，pIRES-neo為真核表達載體，構建了pIRES-ORF81真核表達重組質粒，并研究其免疫效力，研制出高效、新型KHV核酸疫苗。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有良好免疫原性的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗。

本發明所提供的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，是將ORF81基因克隆到真核表達載體pIRES-neo中得到pIRES-ORF81重組質粒。

其中，所述ORF81基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示；其對應的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。

本發明利用將編碼錦鯉皰疹病毒的ORF81基因定向克隆到真核表達載體pIRES-neo中，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒DNA經限制性核酸內切酶鑒定證實含有正確的ORF81基因。用SDS堿裂解法大量提取質粒，通過羅氏FuGENE?HD轉染試劑將重組質粒導入框鏡鯉尾鰭細胞(MFC)內，收集轉染48小時后的MFC細胞，用Western-blot方法檢驗目的基因的蛋白表達情況，證明所構建的真核重組表達質粒成功在MFC細胞中得到了表達。重組表達質粒進行肌肉注射健康鯉魚，每14天免疫一次，共免疫3次，每周心臟采血，利用ELISA方法檢測鯉魚血清中的KHV特異性抗體。用ORF81重組質粒免疫的鯉魚血液中可檢測到KHV的特異性抗體，加強免疫后抗體水平隨免疫次數的增加而增高。采用固定病毒稀釋血清方法，測定ORF81重組質粒免疫后各試驗組鯉魚血清中抗KHV中和效價，ORF81重組質粒免疫組鯉魚血清均產生了明顯的中和抗體。第三次免疫后兩周用100TCID₅₀的KHV對各組鯉魚胸腔攻毒，免疫后的鯉魚保護率顯著提高。對每組鯉魚進行病理切片，顯示免疫鯉魚大大提高了感染后腮、腎、脾、肝的病理狀況。

其中，本發明所用錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）和框鏡鯉尾鰭原代細胞(MFC)均由吉林農業大學動物科技學院實驗室保存提供。

本發明的有益效果：本發明的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗容易生產，在大腸桿菌中可高效克隆；穩定性強，可在大腸桿菌中長期嚴格復制克隆；在魚體內使用安全，由于是真核載體表達保護性抗原所以不會造成病毒擴散；免疫劑量小，所發明的核酸疫苗對鯉魚進行免疫后，載體高效表達，確保了抗原高效持續表達并分泌到胞外，所以免疫劑量極小。

本發明的核酸疫苗目前已在鯉魚上進行試驗，取得了非常明顯保護效率。如果用該疫苗免疫魚，必將大大減少魚患錦鯉皰疹患病機率，保證魚的產量和質量。本發明能使魚建立針對錦鯉皰疹病毒病有效的抗病機制，使養殖戶減少經濟損失。同時減少藥物使用量，從而保證水產品的質量，維護生態穩定性。使用本發明具有重要的經濟效益、社會效益和生態效益。

附圖說明

圖1：錦鯉皰疹病毒中國吉林株（KHV-CJ）的ORF81基因PCR擴增電泳圖，其中M為DNA分子質量標準，2為ORF81基因PCR產物；