[發(fā)明專利]熊果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210415736.6
• 申請(qǐng)日: 2012-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102908353A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔令保;李珊珊;張艷妮;吳曉玉;汪俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K31/56
• 分類號(hào): A61K31/56;A61P31/14;C12Q1/70
• 代理公司: 江西省專利事務(wù)所 36100
• 代理人: 張文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗病毒藥物和試劑研發(fā)領(lǐng)域，尤其是涉及一種熊果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

丙型肝炎病毒（Hepatitis?C?Virus，HCV）嚴(yán)重威脅全人類的健康，全球40%的慢性肝病和80%的肝細(xì)胞癌與HCV有關(guān)。目前沒(méi)有預(yù)防HCV感染的疫苗，目前的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案是聚乙二醇干擾素和病毒唑（Ribavirin）的聯(lián)合治療，這種治療僅對(duì)不足50%的感染者有效。2011年，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)了兩種口服的HCV蛋白酶抑制劑boceprevir?and?telaprevir。這兩種藥物聯(lián)合聚乙二醇干擾素和病毒唑能顯著提高丙型肝炎患者的病毒清除率，但是，這些藥物有副作用，而且對(duì)難治性丙型肝炎患者的治療效果仍然不理想。因此研發(fā)新的有效安全的特異性丙型肝炎治療藥物是國(guó)內(nèi)外HCV基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)的熱點(diǎn)和前沿。?

HCV基因組為正鏈RNA，屬黃病毒科。HCV?的開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)3000多個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白前體。該多聚蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和HCV?編碼的蛋白酶切割后產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(core、E1?和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A?和NS5B)。NS5B蛋白全長(zhǎng)591個(gè)氨基酸，它具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。NS5B的活性喪失會(huì)導(dǎo)致HCV在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制停止。由于正常的宿主細(xì)胞不存在NS5B或其類似物的表達(dá)，抑制NS5B的活性可特異性地阻斷HCV復(fù)制而不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，因此NS5B成為抗HCV藥物篩選的一個(gè)非常理想的靶點(diǎn)。以NS5B為靶點(diǎn)進(jìn)行抗HCV藥物的研發(fā)已有諸多報(bào)道，但是由于安全性或有效性差等原因，尚沒(méi)有一種以NS5B為靶點(diǎn)的抗HCV藥物進(jìn)入臨床使用。?

中藥女貞子長(zhǎng)期以來(lái)作為肝保護(hù)劑藥物使用。申請(qǐng)人前期構(gòu)建了以HCV?RNA為模板的NS5B活性檢測(cè)系統(tǒng)，利用該活性檢測(cè)系統(tǒng)，在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)女貞子水提取物可顯著抑制NS5B的體外和細(xì)胞內(nèi)活性，揭示女貞子水抽提物有望成為抗HCV藥物的來(lái)源。但是，女貞子水提取物的活性成分及其是否具有抗HCV活性仍然不清楚。?

女貞子主要含有三萜類化合物、黃酮類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和對(duì)羥基苯乙醇苷類化合物以及多糖、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油、色素、礦物質(zhì)等多種化學(xué)成分。三萜類化合物在女貞子中的含量約為5.61%，?其中，熊果酸在女貞子中的含量為0.29%。研究表明熊果酸具有抗病毒性炎癥，抗腫瘤、抗菌、降血脂等藥理作用。臨床上熊果酸作為降血脂的藥物。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供熊果酸的新用途，即熊果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用，熊果酸顯著抑制HCV在細(xì)胞感染模型中的增殖，體外和細(xì)胞內(nèi)活性抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCV?RNA依賴的RNA聚合酶NS5B是其作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。?

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：?

一、材料和方法??

1、細(xì)胞和質(zhì)粒

Huh-7.5.1（美國(guó)Francis?V.?Chisari教授惠贈(zèng)），攜帶HCVJFH1(基因型2a)全基因組的質(zhì)粒pJFH1（日本Takaji?Wakita教授惠贈(zèng)），NS5B細(xì)胞內(nèi)活性檢測(cè)報(bào)告載體pcDNA-(-)luc-(-)IRES是通過(guò)把HCV正鏈5′UTR和熒光素酶基因反向連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)獲得。穩(wěn)定表達(dá)NS5B的HepG2-5B細(xì)胞是通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV?基因型?1a的?H?株NS5B至HepG2細(xì)胞獲得。HCV?H和JFH1株的NS5B基因表達(dá)載體是通過(guò)把全長(zhǎng)的NS5B基因或C端刪去21氨基酸的NS5BΔ21基因（確保蛋白在Escherichia?coli?BL21(DE3)表達(dá)的可溶性）分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1()或原核表達(dá)載體pET–His獲得。NS5B基因克隆所用引物如表1所示。

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2、女貞子水提取物的制備和分離

女貞子（購(gòu)于江西南華醫(yī)藥有限公司）溶入雙蒸水（50g/1000mL），放進(jìn)冰箱4°C?過(guò)夜。使用功率可調(diào)控電爐，先大火煮沸，然后小火煎熬2小時(shí)。取煎熬的上清，過(guò)濾除去殘余的水不溶性殘?jiān)＿^(guò)濾后的上清用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯層用硅膠薄層層析板層析，展開(kāi)劑為三氯甲烷：甲醇=18.5：1.5（v/v）。使用乙酸乙酯收集5個(gè)層析組分（命名為組分1-5，圖1），凍干，-70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)，每種凍干組分溶入含2%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基。

3、其它試劑?