[發明專利]埃塞俄比亞芥脂肪酸延長酶及其編碼基因

無效

• 申請號: 201210412942.1
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102978172A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 李密密;杭悅宇;孫小芹;龐慧;李瑩;郭建林;嚴琴琴
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/19;C12N15/09;A01H5/00
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技術領域

本發明涉及分子生物學和基因工程領域，更具體地，涉及埃塞俄比亞芥(Brassica?carinata?A.Braun)脂肪酸延長酶(FAE1)及其編碼基因。

背景技術

芥酸(erucic?acid，C22:1)是一種超長鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科(Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長發育，在植物與環境的相互作用中，參與了生物膜角質或蠟質的合成。從營養價值來說，芥酸是食用油的抗營養成分，不易被人體消化吸收，容易導致冠心病和脂肪肝等病害發生。然而，在工業上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此具有廣泛的用途，是生產潤滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產品的重要原料。

FAE1(Fatty?Acid?Elongase?1)基因是調控芥酸合成的關鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAE1基因以來，陸續有完整的FAE1基因從各種十字花科植物中被分離出來，但目前對于FAE1基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質資源，植物種類多，芥酸含量復雜，是FAE1基因克隆的合適材料。

本發明通過BcFAE1基因的真核表達，獲得活性蛋白，同時脂肪酸含量檢測分析發現該基因所編碼的蛋白對芥酸合成有催化活性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種來自于芥酸含量較高的埃塞俄比亞芥中的脂肪酸延長酶(Fatty?Acid?Elongase?1，FAE1)及其編碼基因。

本發明的埃塞俄比亞芥的FAE1基因由1251個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框，為序列表中的1號序列，將此基因命名為BcFAE1。

本發明的埃塞俄比亞芥FAE1蛋白由506個氨基酸組成，開放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。BcFAE1蛋白的理論分子量為56.37kDa，等電點為9.54。

含有上述序列1及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列1及其開放閱讀框架的多核苷酸轉化的生物細胞，均是本發明需要保護的內容。

本發明基因的發現，使通過轉基因來調控芥酸合成成為可能，對于培育高芥酸的轉基因十字花科作物具有重要意義。

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

附圖說明

圖1為埃塞俄比亞芥基因組DNA

圖2為BcFAE1基因全長PCR擴增產物

圖3為真核表達載體pYES-BcFAE1的構建流程圖

圖4為載體pYES-BcFAE1的酶切圖譜

圖5為酵母中BcFAE1表達產物的Western?Blot分析

具體實施方式

實施例1、基因BcFAE1的克隆

克隆BcFAE1，具體步驟如下：

一、BcFAE1基因的獲得

埃塞俄比亞芥在正常條件下栽培，待真葉長出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進行聚合酶鏈式反應，最終獲得BcFAE1基因。

1、埃塞俄比亞芥基因組DNA的提取

取新鮮幼嫩的活體植物葉片約0.2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉入1.5mL的離心管中，加入500μLCTAB提取液，65℃水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500μL體積比為24∶1的氯仿-異戊醇，混合均勻，12000r·min^-1離心15min；取上清，加2倍體積無水乙醇，-20℃冰箱中過夜；4000r·min^-1離心15min使DNA沉淀；700μL70％乙醇清洗2次，4000r·min^-1離心10min，再用700μL無水乙醇清洗1次，4000r·min^-1離心10min，得DNA沉淀晾干；最后加100μL去離子水使沉淀溶解。電泳檢測結果如圖1所示。

2、聚合酶鏈式反應PCR

以上述得到的埃塞俄比亞芥基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點的TFK(5′CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC?3′)與TRB(5′CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC?3′)為引物，按以下反應擴增出BcFAE1基因。反應體系如下：