[發明專利]一種產氣腸桿菌特異性PCR檢測引物

有效

• 申請號: 201210412342.5
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102952880A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 陳雪峰;楊國梁;王軍毅;高強;張宇飛;黃雪娜
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 湖州金衛知識產權代理事務所(普通合伙) 33232
• 代理人: 裴金華;戴心同

技術領域

本發明涉及一種用于檢測的引物，具體涉及一種用于檢測產氣腸桿菌?PCR檢測的引物，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

產氣腸桿菌(Enterobacter?aerogenes)為革蘭氏陰性菌，主要存在于人和動物的腸道內，亦可存在水、土壤及腐敗物中，同時它也是一種重要的條件致病菌。當宿主機體狀態改變或細菌進入腸道以外的部位，往往會引起感染。近年來，由于第三代和第四代頭孢菌素、碳青酶烯類等超廣譜抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，使該菌的耐藥菌株明顯增多，有些菌株已經表現為多重耐藥。多重耐藥使得臨床上對該菌引起的疾病的治療趨于復雜化。多重耐藥的一個主要原因是未能在第一時間辨明病原菌，在不明病原菌的情況下，濫用藥物，從而導致細菌的耐藥性的出現，導致多重耐藥的產生。因此，臨床上迫切需要一種快速、精準的檢測手段，辨明病原，從而針對性地防治。

傳統的細菌鑒定方法主要是通過細菌生理生化特性進行分類，需要大量的時間進行生理生化反應的結果判讀，不利于及時診斷病因，查找病原。PCR技術具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，已逐步應用于細菌的快速檢測。然而，通過對現有技術的文獻檢索發現，目前尚未有利用PCR技術檢測產氣腸桿菌的報道。

發明內容

?本發明的目的在于提供一種產氣腸桿菌特異性PCR檢測引物。該引物可用于產氣腸桿菌的PCR檢測，具有檢測時間短，成本低，檢測結果特異性高，結果易判斷，實用性強。

本發明是通過以下的技術方案實現的：

一種產氣腸桿菌特異性PCR檢測引物，包括正向引物和反向引物：

正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’

反向引物R：5’-?GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG?-3’。

所述引物在用于產氣腸桿菌的PCR檢測時，具體如下操作：

步驟一，提取樣品DNA，PCR法擴增；

PCR檢測體系為20?μL的反應體系，具體為：

10×PCR?buffer(含Mg²⁺)????2?μL，

2.5mmol/L的dNTP???????1.6?μL，

5?U/μL?的rTaq酶????????0.16?μL，

20?μM的引物對??????????0.8?μL，

模板DNA???????????????1-2?μL，

最后用滅菌雙蒸水補至20?μL；

PCR檢測反應程序為：94℃預變性4min；進入循環，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環；72℃延伸5min，降溫至4℃，結束。

步驟二，取10μL?PCR擴增產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷樣品種是否含有產氣腸桿菌；所述判斷具體為：1%凝膠電泳電泳檢測擴增產物，若電泳結果在201bp出現單一條帶，則說明樣品種含有產氣腸桿菌；反之，則樣品中不含產氣腸桿菌。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：采用本發明的檢測方法檢測產氣腸桿菌所需時間短、特異性強、靈敏度高。本發明避免了采用傳統鑒定方法操作繁瑣、耗時長、準確性低、檢出率低等缺點。同時，本發明所涉及的儀器設備、試劑等較為常用，一般基層實驗室即可開展檢測工作，實用性更強。本發明檢測靶點具有單一特異性，檢測結果特異，易于判定。?

附圖說明

圖1為實施例中PCR檢測方法特異性評估實驗凝膠電泳結果圖；

圖2為實施例中PCR檢測方法靈敏度評價實驗凝膠電泳結果圖；

圖3為實施例中臨床樣品檢測凝膠電泳結果圖。?

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊(New?York：Cold?Spring?Habor?Laboratory?Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

步驟一，設計特異性擴增產氣腸桿菌的引物對

引物序列為：?F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’

R：5’-?GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG?-3’；

步驟二，DNA模板制備