[發明專利]一種對安氏軍團菌的ITS特異的核苷酸及其應用

無效

• 申請號: 201210409489.9
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102876672A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 王磊;劉向前;曹勃陽;馮露
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種對安氏軍團菌的ITS有特異性的核苷酸，其特征在于所述核苷酸包含如下（1）、（2）或（3）所示的序列：

（1）SEQ?ID?NO:1所示的序列；

（2）SEQ?ID?NO:2所示的序列；

（3）具有所述核苷酸功能，?上述（1）或（2）中缺失、替換或插入一個或多個堿基的序列。

2.權利要求1所述核苷酸在制備檢測細菌時作為引物用于PCR試劑盒、作為探針用于雜交反應與熒光檢測，或用于制造基因芯片或微陣列方面的應用。

3.權利要求2所述核苷酸的應用，其中所述的PCR試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的引物指的是：上游引物為SEQ?ID?NO:3，下游引物為SEQ?ID?NO:4，上游引物與下游引物的濃度比為1:1。

4.要求權利要求3所述核苷酸的應用，其中上游引物是根據安氏軍團菌的含有tRNA-Ala間區的ITS類型設計合成的，所述下游引物是根據細菌的23S?rRNA基因保守區設計合成的。

5.權利要求3所述核苷酸的應用，其中所述的PCR試劑盒檢測安氏軍團菌的檢測方法按以下步驟進行：

（1）提取待測樣品DNA模板；

（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl₂、10×酶特異性反應緩沖液、Taq聚合酶、引物、待測樣品模板和ddH₂O，混勻；

（3）將薄壁PCR中混勻的混合物在PCR儀上擴增；

（4）在電泳設備中電泳擴增產物，記錄結果；

（5）分析并進行結果判斷。

6.權利要求5所述核苷酸的應用，其中所述步驟（1）中樣品模板的提取方法為：

（1）將菌液涂布于BCYE平板置于CO2培養箱中培養，并用ddH₂O刮取菌體；

（2）取500μl的ddH₂O重懸沉淀，在8000rpm條件下離心5分鐘，去掉上清液，控干；

（3）取100μl?ddH₂O重懸沉淀，在100℃沸水中水浴10分鐘；

（4）再置于冰上10分鐘后，在12000rpm條件下離心2分鐘；

（5）取3μl中層上清做為PCR反應的模板。

7.權利要求5所述核苷酸的應用，其中所述步驟（3）中PCR儀上的反應循環參數包括DNA的變性、復性、延伸的溫度和時間、循環次數，具體為：

前期為使變性能夠達到所需溫度而必需的前期處理過程的一個循環為95℃，5分鐘；

變性溫度和時間為94℃，30秒；

復性溫度和時間為50℃，30秒；

延伸溫度和時間為72℃，40秒；

變性、復性、延伸的循環次數為35個循環；

為穩定擴增產物而進行一個循環的溫度和時間為72℃，5秒。

8.權利要求5所述核苷酸的應用，其中所述步驟（4）在電泳設備中電泳擴增產物，記錄結果的具體步驟為：

（1）取5～10μl擴增產物與6×溴酚藍上樣緩沖液以5：1的體積比混合；

（2）將混合液上樣于1％的瓊脂糖凝膠上；

（3）將瓊脂糖凝膠電泳120v穩壓電泳約10分鐘，用DL2000?Marker進行對照；

（4）觀察并記錄結果。