[發明專利]一種豬藍耳病基因重組豬霍亂沙門氏菌疫苗及應用

有效

• 申請號: 201210408816.9
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN103421729A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 何啟蓋;楊昆;郭愛珍;陳煥春;劉曉莉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/295;A61K39/12;A61K39/112;A61P31/14;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于動物細菌基因工程疫苗技術領域，具體涉及一種表達高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（或稱豬藍耳病）修飾型ORF5m基因的重組豬霍亂沙門氏菌及疫苗的構建及應用。?

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus,PRRSV)引起的一種能夠導致妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀的病毒性傳染病(Meulenberg?et?al,2000)，又稱藍耳病。該病以妊娠母豬早產、流產、產死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，新生及斷奶前仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道疾病為特征。因其臨床上常以感染豬只的可視黏膜例如耳部、吻突處發紺為特點，所以俗稱“藍耳病”(Blue-earDisease)。我國大陸于1996年首次報道此病并分離到病毒(郭寶清等，1996)，隨后該病在我國呈蔓延趨勢(蔡雪暉等，2000)。目前PRRS已遍及全球主要養豬國家和地區，成為影響養豬業的主要疾病因素之一，給養豬業造成了巨大的經濟損失。2006年以來更是爆發了席卷全國的所謂“豬高熱綜合征”，又稱“豬無名高熱”，研究表明，肆虐我國養豬業的所謂“豬無名高熱”與高致病性PRRSV感染有直接關系。?

GP5由ORF5編碼，長度為200個氨基酸左右，分子量為25～30kD，為糖基化的囊膜蛋白。GP5可誘導產生特異性中和抗體(neutralizing?antibodies,NA)，病毒中和效應與抗GP5抗體滴度呈顯著正相關性。用含編碼GP5的DNA疫苗免疫，可使免疫豬產生抗PRRSV的NA。也有研究表明，該蛋白可引起細胞凋亡(Osorio?et?al.,2002)。Ostrowski等(2002)用具有PRRSV中和性的單抗和豬血清，從PRRSV?cDNA噬菌體文庫中篩選出了2個針對B細胞的抗原位點，即A表位和B表位，它們均位于GP5上。研究證實位點A為非NE，在各PRRSV分離株中高度變異，具有免疫優勢；位點B為NE，在各PRRSV分離株中相對保守，不具免疫優勢。位點A可能扮演了一個誘騙因子的角色，抑制了B表位產生NA的能力，使NA的產生至少推遲了3周，所以在設計基于GP5的PRRSV疫苗時，應考慮將B表位充分展現出來。江云波等（2006）研究證實將PADRE插入ORF5基因的誘騙表位和中和表位間，可以使ORF5基因的NE充分展示給B細胞，從而增強NA產生的水平。因此，如果用修飾型ORF5m基因代替天然的ORF5基因，從而誘發更高免疫反應的優化的GP5蛋白，有望成為新一代疫苗研制的候選靶蛋白。?

同多數病毒性疾病的防制相同，對PRRS的防制仍以疫苗免疫預防為主。目前PRRS商品化疫苗主要是滅活苗和弱毒苗兩種傳統常規疫苗，使用后雖均可減輕臨床癥狀，但不能阻止強毒感染和病豬的排毒及持續性感染的發生。?

（1）PRRS滅活苗：目前，世界上許多養豬國家都已研制生產出PRRS滅活疫苗。例如滅活苗“Cyblue”(西班牙Cyanamid公司產品)，是基于歐洲型分離株的油乳劑疫苗，我國的PRRSV滅活疫苗則是由中國農?業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的基于美洲型分離株CH1a株的油乳劑疫苗，用于預防母豬的繁殖障礙。滅活疫苗最大的優點是安全性好，最大的缺點是免疫次數多、免疫劑量大、免疫產生的保護效力有限。?

（2）PRRS弱毒苗：同PRRSV滅活苗一樣，目前許多國家(包括美國、西班牙、荷蘭等)均已研制出針對PRRS的弱毒苗并商品化。PRRS弱毒苗效果要明顯好于滅活苗(Mengeling?et?al.,1999)。但由于弱毒苗存在毒力返強的風險，所以安全問題仍是豬場長期免疫PRRS弱毒苗最大的憂慮(Storgaard?et?al.,1999)。?

PRRSV不同分離株尤其是不同基因型（群）分離株在毒力、生物學特性、抗原性和遺傳學特性上存在一定差異，因此利用單一PRRSV毒株制備的疫苗不能完全保護免疫豬免受異源毒株的感染，這給PRRS疫苗的研制帶來很大困難，尤其是近年來免疫豬非典型性或急性PRRS的爆發更使人們質疑現有PRRS傳統常規疫苗的免疫效果。因此近年國內外學者一致致力于PRRSV新型疫苗的研發，例如亞單位疫苗、核酸疫苗、感染性cDNA基因突變疫苗等，但是這些疫苗存在成本昂貴及技術要求高等缺陷，難以推廣應用。?