[發(fā)明專利]一株黃單胞菌突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210407313.X
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN102925399A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁如冰;馬辰;劉建華
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P19/02;C12R1/64
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一株黃單胞菌突變體，命名為XC2460，其保藏編號為CGMCC?No.6583。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、通過兩步同源重組法敲除野生型黃單胞菌菌株Xcc?8004的XC_2460基因；

B、分別使用上游引物對XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物對XC_2460-D-F/XC_2460-D-R?PCR擴增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段；

C、以上述兩個擴增的片段為模板，利用引物對XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通過重疊PCR方法，將這兩個片段融合；

D、將兩個融合片段與質(zhì)粒pK18mobsacB進行EcoR?I/HindIII雙酶切，回收酶切片段后，用T4DNA連接酶進行連接，獲得質(zhì)粒pK18mobsacB-Xc2460；

E、最后，借助于輔助菌株E.coli?S17-1(λpir)接合的方式將質(zhì)粒pK18mobsacB-Xc2460轉(zhuǎn)入野生型黃單胞菌菌株Xcc?8004中；首先將接合子在含10μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的平板上進行一次篩選，所得陽性克隆再轉(zhuǎn)入含25μg/ml利福平和5％蔗糖平板上進行二次篩選，得到成功敲除了XC_2460基因的黃單胞菌突變體菌株，命名為XC2460。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌突變體的構(gòu)建方法，其特征在于：所述XC2460-U-F的序列為：GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat；

XC2460-U-R的序列為：Aacacgccgatcagggtcag；

XC_2460-D-F的序列為：

GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatttctacgccaagttc；

XC2460-D-R的序列為：GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃單胞菌突變體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于：通過限制黃單胞菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來提高其在纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中胞外葡萄糖的累積量，葡萄糖作為纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物，其向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運量下降，實現(xiàn)了其在胞外的大量積累，提高了胞外的葡萄糖濃度，有利于后續(xù)的進一步轉(zhuǎn)化。