[發明專利]一種改進的植物花粉管轉化方法

無效

• 申請號: 201210406418.3
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN102864168A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 王丕武;付永平;張君;曲靜;姚丹;馬建;王鑫雨;單睿;關淑艷
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

1.一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：將外源質粒DNA重懸于質粒DNA保護劑中，制成外源質粒DNA的混合液；濃度為0.8-1.2?μg/μL，然后利用植物花粉管通道法轉化到植物中。

2.根據權利要求1所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：所述的外源質粒DNA保護劑，它是氫氧化鋁溶膠保護劑、磷酸鈣保護劑和Tween20保護劑中的一種。

3.根據權利要求1或2所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：所述的外源質粒DNA的濃度為1?μg/μL。

4.根據權利要求1所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的：

（1）在一支玻璃試管中加入2-4mL?1%氯化鋁溶液，再加入0.05-2?mL?10%氨水，使其形成沉淀；

（2）棄上清，用蒸餾水清洗沉淀3-5次，采用傾析法除去水分，最后一次用過濾法使洗液與沉淀分離；

（3）將沉淀轉入150?mL燒杯中，加入蒸餾水20-80?mL，攪拌并加熱煮沸；

期間加入0.1-0.2?mL?0.1?mol/L?HCl溶液，不斷攪拌，即可獲得氫氧化鋁溶膠；

（4）氫氧化鋁溶膠重懸外源質粒DNA。

5.根據權利要求1所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的：

（1）用滅菌蒸餾水5-15?μL重懸外源質粒DNA，使其濃度為1?μg/μL，再加入50-60?μL?2?mol/L?CaCl2溶液混勻；

（2）離心，將上清液取出，加入到400-450?μL滅菌蒸餾水中；得外源質粒DNA-CaCl2溶液；

（3）取一個2?mL滅菌的離心管，向其中加入500?μL，?pH6.95-7.05?，2×HEPES緩沖液，向HEPES緩沖液中以吹氣的方式逐滴滴入外源質粒DNA-CaCl2溶液；

（4）將試管放于37℃水浴中孵育3-5?min，可見乳白色混濁出現；

（5）10000?r/min離心3?min，棄上清；所得的混合物即為磷酸鈣-外源質粒DNA。

6.根據權利要求1所述的一種改進的植物花粉管轉化方法，其特征在于：所述的外源質粒DNA的混合液是由下述的方法制備的：

（1）采用滅菌蒸餾水與蔗糖，配成濃度為8%的蔗糖溶液，115℃滅菌15-20?min；

（2）取上述蔗糖溶液與Tween20混合，制成濃度為5%的Tween20保護劑；

（3）取5%的Tween20保護劑10-20?μL外源質粒DNA。