[發(fā)明專利]一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210406318.0
• 申請(qǐng)日: 2012-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN102924579A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾榮南;馬旭東;黃文華;許慎;黃建麗;黃俊達(dá)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曾榮南;馬旭東;黃文華
• 主分類號(hào): C07K14/00
• 分類號(hào): C07K14/00;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市合道英聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 44309
• 代理人: 劉輝;廉紅果

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有提高人NK及NKT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性的多肽(簡(jiǎn)稱HA-FC)及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中主要的免疫細(xì)胞，在清除腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞中，Ｔ細(xì)胞的CTL發(fā)揮著重要的作用。但是CTL作用的前提是腫瘤或病毒抗原必須與自身細(xì)胞表面的MHC?I類結(jié)合并遞呈在細(xì)胞表面后才能被T細(xì)胞識(shí)別繼而被T細(xì)胞清除，即所謂的MHC限制。然而，多數(shù)的腫瘤細(xì)胞以及部分病毒感染細(xì)胞為了逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，其細(xì)胞表面的MHC?I類表達(dá)通常都明顯下調(diào)甚至消失(稱之為“缺失自我”)。此時(shí)，T細(xì)胞就無法發(fā)揮作用，機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫清除功能則主要由NK細(xì)胞來承擔(dān)。與殺傷性T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞的殺傷活性不需誘導(dǎo)即可直接殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。因此，NK細(xì)胞在腫瘤的過繼免疫治療上，有著廣泛的應(yīng)用前景。

NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用與T細(xì)胞的CTL細(xì)胞毒作用不同，NK的細(xì)胞毒作用不需要腫瘤抗原與MHC結(jié)合，就能夠立即殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。它的活性依靠其細(xì)胞表面的受體與靶細(xì)胞表面的配體相互作用來實(shí)現(xiàn)，這種激活是非特性的激活。此外，NK細(xì)胞還是連接特異性免疫與非特異性免疫的橋梁。抗體介導(dǎo)的特異性殺傷作用在NK細(xì)胞的抗腫瘤與抗病毒中也具有重要的作用。NK細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC作用(“抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”，antibody-dependent?cell-mediated?cytotoxicity)。在抗體介導(dǎo)的ADCC作用過程中，抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，而NK細(xì)胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NK細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。在抗腫瘤與抗病毒免疫中，通過ADCC的效應(yīng)，能使NK的抗腫瘤、抗病毒活性發(fā)揮更高、更強(qiáng)的效能。

NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞具有類似的抗腫瘤活性，但兩種細(xì)胞來源不同：NKT來源于T淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞直接由淋巴系干細(xì)胞分化而來。表面標(biāo)記上：NK細(xì)胞為CD56陽性、CD3陰性；NKT為CD56陽性、CD3陽性。

噬菌體隨機(jī)肽庫是一種有效尋找能與某一特定目標(biāo)蛋白特異結(jié)合的蛋白并確定其氨基酸序列的技術(shù)方法。噬菌體隨機(jī)肽庫有商品化的產(chǎn)品，篩選的結(jié)果取決于包被在96孔板上的目標(biāo)蛋白。商品化的噬菌體隨機(jī)肽庫是由上億種氨基酸隨機(jī)排列的短肽與噬菌體外殼蛋白在基因水平進(jìn)行連接后，以融合蛋白的形式表達(dá)(呈現(xiàn))在噬菌體表面的多肽。庫中上億種多肽分別呈現(xiàn)在上億個(gè)噬菌體表面，眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機(jī)肽庫。隨機(jī)肽庫所用的噬菌體為絲狀噬菌體。噬菌體隨機(jī)肽庫含有的大量不同序列結(jié)構(gòu)多肽可作為篩選與任何靶蛋白表位結(jié)合的模擬肽。利用噬菌體肽庫技術(shù)已經(jīng)確定了許多蛋白分子的相互作用位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明依據(jù)NK細(xì)胞借助抗體發(fā)揮ADCC作用的理論，首先，通過噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)，分別篩選到了一條能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”(腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的一種抗原，廣泛存在于各種惡性腫瘤細(xì)胞中)特異結(jié)合的多肽：Gln?His?Ile?Arg?Glu?Leu?Pro?Tyr?Thr?Gly?Gly?Ser?Ala?Arg?His?Tyr?Gly?Ser?Ser?Tyr?Tyr?Phe?Asp?Tyr；以及一條能與CD16特異結(jié)合的多肽：Ile?Asn?Pro?Ala?Trp?Phe?Ala?Tyr?Gly?Gly?Ser?Gln?Gln?Ser?Asn?Glu?Asp?Pro?tyr?Thr。在此基礎(chǔ)上，通過人工肽合成的方式，將這兩條肽的特點(diǎn)(氨基酸序列)合成在一條完整的肽鏈上，即本發(fā)明所指的多肽HA-FC。該多肽的氨基端具有模擬抗體的功能，能與腫瘤抗原“天冬酰胺羥化酶”特異結(jié)合；多肽的羧基端則模擬抗體的Fc段功能，能夠與NK細(xì)胞上的CD16分子結(jié)合。通過HA-FC多肽的橋梁作用，NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞更貼近、結(jié)合更加牢固，最終使NK細(xì)胞通過釋放穿孔素與顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞的效率更高。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是獲得了(篩選到了)能與天冬酰胺羥化酶特異結(jié)合的肽序列和能與CD16結(jié)合的肽序列。申請(qǐng)者采用噬菌體隨機(jī)肽庫的方法，分別以天冬酰胺羥化酶以及CD16為目標(biāo)蛋白，對(duì)噬菌體肽庫中能與天冬酰胺羥化酶結(jié)合的克隆以及肽庫中能與CD16結(jié)合的克隆分別進(jìn)行了篩選。篩選所用的目標(biāo)蛋白是采用人工合成的天冬酰胺羥化酶肽段以及人工合成的CD16肽段，以這兩種合成的多肽分別包被96孔板進(jìn)行篩選。