[發(fā)明專利]人工合成用于轉基因抗除草劑植物的EPSPS基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210406176.8
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN103074351A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 賴錦盛;趙海銘;宋偉彬
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于植物分子生物學和植物遺傳工程學領域。具體的說，本發(fā)明涉及一種抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因及其在抗草甘膦植株選育、組織細胞培養(yǎng)中的應用。

背景技術

N-膦酰甲基甘氨酸，也稱草甘膦，是使用最為廣泛的廣譜除草劑，具有對人畜無毒，自然條件下雜草和農作物難以對其產生抗性，低土壤殘留量、易于被微生物分解等特點，已廣泛應用于農業(yè)生產中，成為目前世界上生產量最大的除草劑品種。然而由于草甘膦無選擇性的殺死雜草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物種植區(qū)使用，這便制約了其在農業(yè)上的應用。為了獲得抗草甘膦作物，從上世紀80年代，人們便開始培育抗草甘膦農作物，其中最成功的例子是將改良的草甘膦靶標酶EPSP合酶導入植物中，以提高轉基因植物對草甘膦的抗性。

草甘膦是通過抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，該酶催化莽草酸代謝途徑倒數(shù)第二個反應。正常情況下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與3-磷酸莽草酸(S3P)反應生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和無機磷。由于草甘膦與PEP結構相似，在植物和微生物體內可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦復合物，阻截PEP與酶的結合，從而阻斷芳香族氨基酸的合成。該酶只在植物和微生物中存在，在動物體中不存在。在一些極端環(huán)境下，如長期噴灑草甘膦的農田、草甘膦工廠的廢液池以及人為的加大對某植株草甘膦的選擇壓力等，發(fā)現(xiàn)了部分對草甘膦具有耐受能力的細菌和植物。如Amrhein等人通過逐漸增加草甘膦的濃度，分離到一個耐受草甘膦的矮牽牛細胞系；Baerson等人在長期噴灑草甘膦的果園中發(fā)現(xiàn)了一株耐受草甘膦的牛筋草，經過后期實驗證明這些抗性的產生均為EPSPS基因發(fā)生了突變，導致了其與草甘膦的結合能力降低，并且保證了正常的催化能力。植物可以通過轉化對草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農桿菌CP4、熒光假單胞菌G2和Salmonella?typhimurium?CT7的EPSPS已經在植物中得到廣泛的驗證和應用。

在植物和某些細菌中發(fā)現(xiàn)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)對草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通過表達與草甘膦具有較低親和力的EPSPS而獲得，存在草甘膦時此酶也仍然保持其催化活性。植物對草甘膦耐受或對草甘膦具有抗性是指用草甘膦除草劑噴施植物后，植物可以正常生長發(fā)育。

現(xiàn)已被確定EPSP合成酶分為兩個家族(Ming?He等2001)，家族I包括來源于大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的EPSP合成酶；家族II包括來源于根癌農桿菌CP4、無色桿菌LBAA、假單胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗體與家族I的EPSP合成酶不發(fā)生交叉反應，且兩者間的氨基酸同源性低于50％。

在天然的植物EPSPS基因中，葉綠體轉運肽區(qū)域包含在天然的編碼序列中(例如：CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987)，CTP在葉綠體膜上從EPSPS酶上裂解下來，產生成熟的EPSPS。葉綠體轉運肽對EPSPS酶行使正常功能是必須的，在蛋白結構及功能一致的前提下，如果去掉信號肽，雖然整個植物組織EPSPS蛋白表達量一致，但是植株確不具有草甘膦抗性，不同來源的信號肽對EPSPS蛋白在不同轉化受體中行使功能的效率存在差異(Guy?della?Cioppa?1988，Guy?della?Cioppa1986)。

密碼子偏愛性是一個阻礙細菌基因在植物中表達的障礙。對于一個給定氨基酸的同義密碼子，不同的物種會有不同的偏愛性。例如在苜蓿中精氨酸的密碼子CGU出現(xiàn)的概率是罕見密碼子CGG的50多倍。而在玉米中AGG和CGC是精氨酸常用密碼子，CGG也經常被使用。玉米中許多常用密碼子卻在細菌中很少見，反之亦然。來源于細菌P.luminescens的兩個殺蟲蛋白基因(tcdA和tcbA)的密碼子使用頻率中可以發(fā)現(xiàn)(Patent?No.US6，590，142B1)，丙氨酸的GCG密碼子，谷氨酸的GAA密碼子，亮氨酸的CTG密碼子并沒有在這兩個細菌基因中使用。但是這些密碼子在玉米中的使用頻率大約是23％、20％和26％。所以對于來源于細菌的基因在轉入植物之前都要根據(jù)宿主植物進行基因改造和密碼子優(yōu)化。