[發明專利]一種基于抗體定向固定和納米復合材料免疫傳感器制備方法

有效

• 申請號: 201210405208.2
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN102879575A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 孫霞;朱盈;王相友;劉君峰;翟晨
• 申請（專利權）人: 山東理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/531
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技術領域

本發明提供一種基于抗體定向固定和納米復合材料的免疫傳感器制備方法，屬于生物傳感器技術領域。

背景技術

近年來，農藥殘留引起的中毒事件屢屢發生，果蔬中的有害、劇毒農藥的殘留問題一直是人們關注的焦點，也是現今中國加入WTO后，農產品出口遭遇“綠色壁壘”的主要影響因素之一。克百威是氨基甲酸酯類殺蟲劑主要品種之一，它作為一種光譜殺蟲劑被廣泛應用于當今農業中。該藥劑具有內吸性，能通過根、莖、葉或種子吸收傳導，并輸送到植物體的各器官，也能通過徑流滲透污染地下水。研究發現克百威的代謝物可引起細胞強烈的DNA單鏈斷裂，具有明顯的細胞毒性。雖然近年來國際上在蔬菜上已禁用該農藥，但由于其對某些作物具有生長刺激作用，所以仍有不少違章使用現象。具有這樣高毒性的農藥殘留超標的果蔬流入市場，必將會對人們健康造成嚴重危害，因此建立一種快速、靈敏、安全可靠的農藥殘留檢測分析方法迫在眉睫。

傳統的用于檢測農藥殘留的分析方法有：氣相色譜（GC）、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質譜聯用技術(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯免疫(ELISA)等，這些傳統的方法雖然具有高選擇性和靈敏度，但其受到樣品前處理耗時、儀器設備昂貴、操作人員技術要求高、檢測時間長等諸多因素的限制，只能局限于實驗室操作，不能滿足果蔬現場速測的要求。免疫傳感器是根據抗原和抗體特異性結合所引發的免疫反應的原理研制成的傳感器，與傳統的分析方法相比,它具有特異性強、分析速度快、結構簡單、成本低廉等優點。在電流型免疫傳感器的制備過程中，抗體（Ab）或半抗原（hapten）的固定化并保持其良好的生物活性、空間排布以及信號的放大是制約傳感器靈敏度、穩定性、選擇性以及再生性能等的關鍵因素。

發明的目的在于提供一種能克服上述缺陷、操作簡單、靈敏度高，選擇性好的檢測農藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法。

其技術方案為：一種基于抗體定向固定和納米復合材料的免疫傳感器制備方法，其特征在于：實現抗體定向固定，抗克百威的單克隆抗體（Ab）以谷胱甘肽（glutathione,?G-SH）作為空間手臂被定向共價固定到納米金膠表面。

所述的一種基于抗體定向固定和納米復合材料的免疫傳感器制備方法，其特征在于：分別制備多壁碳-殼聚糖（MWCNTs-CS）、石墨烯-聚乙烯亞胺-納米金（GS-PEI-Au）兩種納米復合材料，并利用這兩種納米材料的協同作用共同修飾電極，以放大響應電流。

所述的一種基于抗體定向固定和納米復合材料的免疫傳感器制備方法，其特征在于：實驗條件的優化，主要包括測試底液的pH、孵育溫度以及孵育時間；所制備的免疫傳感器的工作曲線為：%ΔI?=?14.275?+?11.087?lgC?(ng/mL)，(R²=0.9889.)，其檢測限為0.03ng/mL；免疫傳感器性能檢測包括特異性、穩定性、重現性、再生性以及免疫傳感器對多種果蔬樣品回收率的測定。

其制備原理為：本發明采用谷胱甘肽（glutathione,?G-SH）作為空間手臂將抗克百威的單克隆抗體（Ab）定向共價固定到納米金膠表面，其中G-SH通過金硫鍵牢固的固定到納米金膠表面，G-SH末端羧基（–COOH）經1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺（EDC）和1,6-己二胺（DAH）活化后，共價結合抗體C末端的–COOH，從而實現了Ab定向連接在納米金膠表面。抗體的定向固定保持了抗體的生物活性以及自由的抗原結合位點來和農藥有效的特異性結合。采用多壁碳-殼聚糖（MWCNTs-CS）、石墨烯-聚乙烯亞胺-納米金（GS-PEI-Au）兩種納米復合材料共同修飾電極，顯著的增強了電流響應，擴大了電極的有效固定面積，提高了電極表面抗體的有效固定量。將經過上述步驟修飾過的電極制成免疫傳感器后，檢測農藥的精度更高、實現小型、便捷、適用于現場檢測的目的。采用本發明制成的免疫傳感器可以在蔬果采收、上市前，進行農藥克百威殘留的快速測定，直接對農藥殘留是否超標量進行檢測，避免因食含有殘留農藥的蔬果而引起中毒，為農產品安全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。

為達到以上目的，采取以下技術方案實現：一種基于抗體定向固定和納米復合材料的免疫傳感器制備方法，其特征在于：⑴通過共價方法將抗體定向的固定在納米金膠表面，抗體的定向固定保持了抗體的生物活性以及自由的抗原結合位點來和農藥有效的特異性結合；⑵基于MWCNTs-CS和GS-PEI-Au兩種納米復合材料的協同作用，將其共同修飾電極。