[發明專利]一種反硝化菌的保藏方法

有效

• 申請號: 201210404038.6
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN103773684A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 孫丹鳳;高會杰;張鵬;李寶忠
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種菌體保藏方法，具體涉及一種簡單有效的低溫冷凍保藏反硝化菌的方法。

背景技術

氨氮是國家實現水污染控制總量控制的污染物，水體中氨氮含量過高會引起水質富營養化，導致水體中某些藻類過度繁殖，其它生物生長受到影響，從而破壞了水生生態系統，導致水質惡化并影響到其使用功能。生物脫氮技術以其環保高效無二次污染等優點是目前國內外脫氮技術研究應用的熱點。生物脫氮是在好氧條件下通過硝化反應先將氨氮氧化為硝氮或亞硝氮，再通過缺氧條件下的反硝化反應將硝氮或亞硝氮還原成氣態氮從水中除去。由此可見，反硝化過程才是真正脫氮的步驟，而完成反硝化的高性能反硝化菌被選育出來后，如何能夠長期有效的保藏至關重要。

微生物菌種是重要的生物資源之一，一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低菌體性能，能長期應用于生產中。菌種保藏的基本原理主要是根據其生理生化特征，人工創造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態，即采取低溫、干燥、缺氧等條件，使菌種暫時處于休眠狀態。一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經濟，以便在生產上能推廣使用。為了有效地保藏微生物菌種，就需要針對菌種的特性研究選用適宜的保藏方法。菌種保藏方法很多，目前國內外常用的有定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、超低溫冰箱冷凍法、超低溫液氮冷凍法等。其中定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法不適合大量菌種的保藏；超低溫液氮冷凍法和超低溫冰箱冷凍法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等，目的是防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。冷凍保存是解決種質退化和防止自然積累性突變的一種有效途徑，但傳統的低溫保存需要昂貴的程序降溫儀器，步驟繁瑣。完全玻璃化是低溫保存的一種新方法，即在高濃度保護劑下，細胞連同保護劑于快速降溫中都進入玻璃化狀態，避免胞內冰晶形成，使器官和組織各部分都進入相同的狀態，具有設備簡單、程序簡單和凍存效果好等優點。但是保護劑僅能保證菌體的存活率，對菌體活性是否有影響及影響的程度還不明確。

CN200810124325.5提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養的方法：將菌種接種于無菌的半固體培養基中，倒入無菌液體石蠟后豎直存放入6～8℃的環境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。采用此方法可延長菌種的保存時間，同時菌種的濃度保持相對穩定，為生產、試驗節約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對環境的危害。但是工序復雜繁瑣，不適合大量菌體的保藏。

CN201010299763.2提供了一種冷凍保存紅細胞的方法，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N～乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，還原劑終濃度各為0.5～300mM；甘油的量以終體積比計為5%～10%；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1～10mM；充分混勻并調節酸度值至6.5～8.0，將容器封口，靜置1小時后在-40℃以下冷凍保存。以該方法冷凍保存的紅細胞，一年后解凍，紅細胞破碎率大于95%，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。此種方法適合細胞保藏法，不適合菌種活性的保藏。

CN200810190852.6涉及一種菌種保藏方法，包括：(1)將需要保藏的菌種接種到滅過菌的麩皮培養基中；培養基配方為50～60%麩皮、35～45%粉碎后的谷殼、1～2%硝酸鈉、1～2%尿素、1～2%米粉、0.2～1%生物素營養添加劑，加入上述混合物相同重量的去離子水，混合均勻即可；(2)當菌絲長到需要的菌齡時，不需分離出菌絲制成菌懸液，直接將凍干液立即加入安瓿管中與培養物混合均勻；凍干液配方為10～20克脫脂牛奶、0.2～0.5克瓊脂粉、0.2～0.5克還原型谷胱甘肽、0.1～0.5克阿拉伯膠、0.5～1克叔丁醇，用去離子水定容到100毫升；(3)然后以2℃/分鐘的降溫速率降溫，冷凍干燥；(4)凍干后對盛菌的安瓿管抽真空，然后封口；以及(5)將所得到的管置入低溫下保藏。該法采用真空冷凍干燥法保藏菌體，需要采用緩慢的降溫程序將菌體凍干進而低溫保藏，步驟繁瑣，能耗較高。