[發(fā)明專(zhuān)利]一種乙酰木聚糖酯酶及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210403666.2
• 申請(qǐng)日: 2012-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102952787A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃和;李霜;田倩倩;宋萍;徐晴
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/18
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/18;C12N15/63;C12P7/40;C12P35/00;C12P35/06
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）中獲得的新型酯酶及表達(dá)載體、重組酯酶及重組酯酶在水解短鏈脂肪酸脂、去酰基化反應(yīng)及β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的重要中間體-去酰基化的7-氨基頭孢烷酸及去酰基化頭孢菌素C中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

乙酰木聚糖酯酶（acetyl?xylan?esterase，縮寫(xiě)AXE）是一類(lèi)可以將木聚糖或低聚木糖中的酰基化的吡喃木糖去酰基化并釋放出醋酸的酯酶，分類(lèi)于羧酸酯酶家族7，可以水解短鏈脂肪酸及各種酰基化化合物，具有廣泛的底物特異性。?

現(xiàn)今，乙酰木聚糖酯酶表現(xiàn)出巨大的科研價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。一方面，乙酰木聚糖酯酶在半纖維素木聚糖的降解中起重要作用。該酶與內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L呋喃型阿拉伯糖苷酶及α-葡萄糖醛酸酶一起構(gòu)成木聚糖降解酶系，能水解具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的半纖維素木聚糖，使得開(kāi)發(fā)和利用自然界中取之不盡的可再生資源成為可能，近些年獲取高活力的乙酰基木聚糖酯酶及解析此酶的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。另一方面，乙酰木聚糖酯酶具有良好的酰基酯酶活性，可以催化7-氨基頭孢烷酸和頭孢菌素C脫酰基合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素母核，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。β-內(nèi)酰胺抗生素是抗生素中的最主要類(lèi)型之一，全世界耗用量過(guò)萬(wàn)噸。目前使用的化學(xué)法存在成本高、三廢污染嚴(yán)重等問(wèn)題，很多制造領(lǐng)域已愈來(lái)愈趨向使用酶法合成。?

目前已知報(bào)道的生產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶的芽孢類(lèi)微生物有Bacillus?pumilus、Bacillus?subtilis?ATCC6633、Bacillus?subtilis168、Bacillus?halodurans?C-125等。其中，除Bacillus?subtilis?ATCC6633的乙酰木聚糖酯酶被報(bào)道具有較高pNPA酶活力（1580?U/mg）外，其他菌株的乙酰木糖酯酶的活力和性能仍然較差，限制了其在半纖維素降解和酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素中廣泛應(yīng)用。因此，需要開(kāi)發(fā)一種高活性的乙酰木聚糖酯酶，擴(kuò)大其使用范圍。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種新型的乙酰木聚糖酯酶的編碼氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。?

本發(fā)明的第二個(gè)技術(shù)目的是提供乙酰木聚糖酯酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中，以同源六聚體的活性最高。?

本發(fā)明的第三個(gè)技術(shù)目的是提供包括乙酰木聚糖酯酶的編碼基因的表達(dá)載體。?

本發(fā)明的第四個(gè)技術(shù)目的是提供制備重組乙酰木聚糖酯酶的方法。?

本發(fā)明的第五個(gè)技術(shù)目的是提供重組乙酰木聚糖酯酶在水解短鏈脂肪酸脂、去酰基化反應(yīng)、生產(chǎn)去酰基化的7-氨基頭孢烷酸及去酰基化頭孢菌素C中的應(yīng)用。?

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：?

本發(fā)明利用PCR技術(shù)從枯草芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出Cah基因，將Cah基因連在表達(dá)載體pET22b多克隆位點(diǎn)處，得到重組質(zhì)粒pET-Cah，再將重組質(zhì)粒pET-Cah轉(zhuǎn)化E.?coli?BL21?(DE3)，得到重組的大腸桿菌，即產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶的基因工程菌E.?coli?BL21-pET-Cah。

菌株培養(yǎng)后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生重組乙酰木聚糖酯酶，對(duì)重組乙酰木聚糖酯酶分離即可。詳細(xì)的操作過(guò)程見(jiàn)實(shí)施例1和實(shí)施例2。?

按照本發(fā)明的技術(shù)方案，可以達(dá)到良好的技術(shù)效果：?