[發明專利]似活的非可培養狀態的可培養細菌及其制備方法

無效

• 申請號: 201210403602.2
• 申請日: 2012-10-22
• 公開（公告）號: CN103031360A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 李影;段銳;錢愛東;張文慧;李瑩
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N1/20;C12R1/42
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養細菌及其制備方法。

背景技術

細菌VBNC狀態是指細菌在不良環境中，細胞縮成球形，用常規方法（平板法、最大可能近似值法）培養時，不能生長繁殖，但仍然是活的一種特殊存在形式。

細菌活的非可培養狀態(Viable?but?Non-culturable,?VBNC)的復蘇是指將不能培養的細菌恢復為可培養狀態的過程，目前，國內外用于VBNC沙門氏菌復蘇的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年發表在Applied?and?Environmental?Microbiology?刊物上的一篇題為《Resuscitation?of?Salmonella?enterica?Serovar?Typhimurium?and?Enterohemorrhagic?Escherichia?coli?from?the?Viable?but?Nonculturable?State?by?Heat-Stable?Enterobacterial?Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙門氏菌復蘇所需主要材料為含有30％牛血清和50μmol/L去甲腎上腺素的SAPI培養基，基中SAPI培養基成份較為復雜，由6.25mmol/L?NH₄NO₃，1.84mmol/L?KH₂PO₄，3.35mmol/L?KCl，1.01mmol/L?MgSO₄，2.77mmol/L(pH=7.5)葡萄糖等組成。主要復蘇步驟如下：首先將SAPI培養基6000?r/min，離心15min，上清液過濾除菌。然后將濾后的上清液涂于羊血瓊脂平板上，37℃厭氧培養48h，以檢測培養基中是否有雜菌污染。最后將可能含有10²～10³?個CFU/mL濃度的VBNC沙門氏菌無菌接種于SAPI中，37℃厭氧培養至OD₆₂₀＝0.4時，細菌數量增多，濃度可接近10⁸個CFU/mL。通過此法可以使維持VBNC長達1年的細菌恢復為可培養狀態。

細菌VBNC狀態自20世紀80年代發現至今，一直是預防醫學、流行病學、微生物生態學以及公共衛生檢驗檢疫方面研究的熱點問題之一?，F階段，人們已在VBNC細菌誘導、檢測、致病性等方面取得重要成果，并且在分子水平上也對該狀態有了進一步地了解和認識。但是擺在現階段的一個瓶頸問題，即VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，這使得研究者無法做更為深入地研究。也就是說，只有準確捕獲VBNC狀態，才能對該狀態細菌進行系統研究。然而遺憾的是，在VBNC領域中至今尚未獲得具有穩定遺傳性狀的研究模型。也正因如此，有關VBNC狀態發生機制的研究也只停留在某一（些）已知基因（如大腸桿菌、霍亂弧菌的毒力基因）在正常與VBNC狀態下表達情況的比較，尚未能對VBNC發生機制做客觀評述。因而，憑借VBNC特異性基因建立針對VBNC細菌檢測方法的研究也只能停滯不前。盡管應用高通量的基因芯片技術能合理躲避瓶頸問題，可對VBNC發生機制進行深入研究，但是繁雜的工作以及大量的資金投入亦會使更多的研究者卻步。

發明內容：

本發明目的是解決VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，使得研究者無法做更為深入地研究的問題，而提供一種VBNC細菌的研究模型，似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養細菌及其鑒定方法。

似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養細菌的鑒定方法，它包括：用常規的進入VBNC狀態誘導方法誘導，可培養的既為似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養細菌;?

同時設立對照組，所述的對照組為和待檢細菌相同種類的標準細菌；對照組用常規方法培養不可培養；

所述的不可培養，連續常規培養3次，每次平板菌落數均為0。

所述的常規的進入VBNC狀態誘導方法為在適合該種細菌的液體培養基中，4℃培養。

似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養細菌，它是通過上述方法中的任意一種方法鑒定的可培養細菌。

似活的非可培養狀態（VBNC）的可培養鼠傷寒沙門氏菌，保藏號為CGMCC??No.??6578??。