[發明專利]一種復合人的骨髓間充質干細胞的甲殼素纖維增強膠原基骨組織工程支架及制備方法

無效

• 申請號: 201210401919.2
• 申請日: 2012-10-22
• 公開（公告）號: CN102989041A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 李曉明;黃瑾;牛旭峰;樊瑜波
• 申請（專利權）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/26;A61L27/24;A61L27/20;A61L27/18;A61L27/56
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1.一類新穎的三維多孔纖維增強材料與人的骨髓間充質干細胞復合而成的骨組織工程支架。所述三維多孔材料由礦化膠原MC、高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強纖維CHF復合而成。

2.根據權利要求1所述的膠原為I型牛皮膠原；高分子材料聚乳酸PLA為聚L-乳酸或聚D,L-乳酸，分子量為1.0×10⁵-2.0×10⁵kDa；甲殼素纖維CHF的斷裂強力為4.5-4.7cN，其表面經過脫乙酰基處理，脫乙酰度為80-85％。

3.根據權利要求1所述的礦化膠原MC是由膠原經鈣鹽溶液與磷酸鹽溶液處理后得到，它不但提高了其力學整合性，也使得材料的成分更加接近于天然骨。聚乳酸PLA對整個三維材料起支撐作用，通過溶于有機溶劑并在模具中冷凍干燥，得到多孔材料。甲殼素纖維CHF的功能之一是起增強作用，功能之二是因為它的降解產物本身具有明顯的堿性，從而在體內中和聚乳酸的酸性降解產物。

4.根據權利要求1所述的三維多孔材料采用物理混合和超聲波分散技術相結合的方法復合而成。采用模具成型和隨后的冷凍干燥以獲得三維多孔結構。所述人的間充質干細胞為hBMSC為人胚胎骨髓間充質干細胞。整個骨組織工程支架的制備方法包括下列各步驟：

(1)制備礦化膠原MC。首先將膠原溶解于乙酸中，然后在膠原溶液中依次緩慢滴加等量體積的0.5M?CaCl₂和0.3M?Na₂HPO₄，之后在攪拌同時緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8。靜置溶液2～4天，除去上清，離心分離出沉淀，沉淀物用去離子水反復清洗三次后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后研磨制得干粉即為礦化膠原MC。

(2)確定合適的聚乳酸PLA和甲殼素纖維CHF添加比例。PLA和CHF按不同比例分別浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分別在一定時間內測定浸泡液的pH值，最后選用pH值波動較小的PLA和CHF的添加比例。經過反復實驗得出當CHF和PLA的質量含量之比為0.25-0.3時，材料浸泡液pH值波動最小。

(3)確定甲殼素纖維CHF的合適長度。纖維只有在其長度大于一個臨界長度的情況下，才能對基體產生增強作用。但是在纖維含量一定的情況下，如果纖維的長度太長，增強材料的壓縮強度會略有下降。在本試驗所能涉及的范圍內，經過多次重復，得到甲殼素纖維CHF的合適長度為1.4-1.6mm。

(4)將分子量為1.0×10⁵-2.0×10⁵kDa的聚乳酸PLA溶于1,4-二氧六環中，配成濃度為100-150g/L的溶液。加入一定含量礦化膠原MC粉末（PLA：MC=1），超聲波分散30-60min，然后加入加入一定含量的甲殼素纖維CHF（CHF：PLA=0.25-0.3），在常溫下經過2-4小時的磁力攪拌并超聲波分散3-5小時，制得骨組織工程材料混合液體。

(5)采用冷凍干燥的方法制備三維多孔骨組織工程材料。將上述第4步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20℃冰箱中冷凍24-48小時后，將模具轉移到冷凍干燥機中冷凍干燥24-36小時，為了將溶劑徹底清除，冷凍干燥后的材料需在40-60℃的真空干燥箱中烘干24-48小時。之后，將材料用環氧乙烷蒸氣消毒6-12小時，即為本發明所述的三維多孔骨組織工程材料。

(6)人的骨髓間充質干細胞hBMSC與三維多孔材料共培養。將購買到的2-3代人胚胎骨髓間充質干細胞以1-3×10³cells/cm²的密度接種在上述第5步制備的三維多孔骨組織工程材料上，待4-6小時細胞貼壁后加入含有10%的胎牛血清DMEM培養液,培養液每3天換新液。7天后用PBS沖洗三次材料以除去沒有粘附到材料的細胞。最終得到本發明所公開的復合人的骨髓間充質干細胞的甲殼素纖維增強膠原基骨組織工程支架。