[發明專利]一種高密度培養基因工程菌制備褐藻膠裂解酶的方法

無效

• 申請號: 201210401888.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102864136A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 汪立平;李安雪
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所 31251
• 代理人: 王法男

技術領域

本發明涉及一種裂解酶的制備方法，尤其是一種高密度培養基因工程菌制備褐藻膠裂解酶的方法。

背景技術

褐藻膠又稱海藻酸鈉，它是從海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻植物中提取的天然高分子多糖聚合物，是褐藻細胞壁的主要組成物質之一；由α-L-1,4-古羅糖醛酸(G)及其差向異構體β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)組合而成。褐藻膠分子中包含三種結構區域：多聚古羅糖醛酸(poly(G))、多聚古羅糖醛酸(poly(M))和雜聚的隨機序列(poly(MG))。

近年來，隨著海洋生物制藥業的蓬勃發展，海藻多糖的研究日益受到重視，并且隨著海藻寡糖具有促生長、增強免疫力、抗腫瘤、抑菌、抗氧化、整腸、解毒、降血糖血脂、免疫調節等多種生理活性的發現，海藻寡糖在生物醫藥領域巨大的應用潛力也越來越受到關注。

褐藻膠裂解酶能通過β-消除反應裂解褐藻膠的糖苷鍵，產生在非還原末端有C4,5不飽和雙鍵且在230~240nm有強吸收功能的不飽和糖類醛酸、以及飽和單糖醛酸。根據降解褐藻膠部位與片段的不同可以分為三大類：專一性水解聚古羅糖醛酸的1,4-α-古羅糖醛酸裂解酶(EC?4.2.2.11)；專一性水解聚甘露糖醛酸的1,4-β-甘露糖醛酸裂解酶(EC?4.2.2.3)；第三類是既可降解聚古羅糖醛酸，也可降解聚甘露糖醛酸褐藻膠裂解酶。褐藻膠裂解酶越來越多地被應用于分子生物學、海洋生物學、醫藥、化工、農業等領域，褐藻膠裂解酶日益成為海洋生物資源研究開發的競爭熱點。

已有研究表明：褐藻膠裂解酶是研究褐藻膠的化學結構以及細菌的褐藻膠代謝等方面的必備工具酶；褐藻膠裂解酶還用作海藻解壁酶，以獲得DNA、單細胞和原生質體。此外，褐藻膠裂解酶本身具有一定藥用價值，能降解綠膿桿菌的生物膜，恢復病原菌對抗生素的敏感性，可用于輔助治療綠膿桿菌引起的慢性感染，治療肺部囊性纖維化(Cystic?Fibrosis,CF)。因此褐藻膠裂解酶的研究生產有著深遠的理論意義和應用價值，已成為目前的熱點。

同時，隨著近年來褐藻膠裂解酶越來越多的應用于醫藥、食品、化工、農業、分子生物學、海洋生物學等領域，褐藻膠裂解酶日益成為海洋生物資源研究開發競爭的熱點。

目前，國內外對于褐藻膠及其裂解酶的研究主要集中在一下幾個方面：

1、褐藻膠降解工藝的研究；

2、褐藻寡糖的功能性研究；

3、褐藻膠裂解酶的分子生物學研究等幾個方面。

到現在為止，國內外市場均未見有褐藻膠裂解酶制劑的產品，并且對于褐藻膠裂解酶的制備、生產方面的研究報道也較少，即使進行了相關的研究，得到的褐藻膠裂解酶的活性較低，不能滿足深入研究及工業生產使用的要求。

發明內容

本發明的目的在于：針對現在已經報道的褐藻膠裂解酶基因工程菌搖瓶發酵制備的酶活性較低的問題，提供一種利用基因工程菌制備褐藻膠裂解酶，并提高其活性的方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下：

這種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養生產褐藻膠裂解酶的方法步驟如下：

1)將褐藻膠裂解酶基因工程菌從保藏的甘油管取出接種于LB液體培養基中，35-37℃,轉速為150r/min，培養10-12h，得到活化液菌種；

2)將上述活化液菌種轉接至LB種子培養基中，在35-37℃,轉速為150r/min，搖瓶培養10-12h，得到種子液；

3）將上述2%種子液轉接至含有3L發酵培養基的5L發酵罐中，進行高密度發酵培養，待發酵到第4h時開始流加補充培養基；并在發酵到第4.5h后進行IPTG誘導；發酵過程中發酵罐的參數設定為：溫度35-37℃，轉速280rpm/min，溶氧40%-50%，發酵24h，得到發酵液；

4）將上述發酵液在4℃下、經12000rpm/min離心10min去除上清液，收集菌體，將菌體在冰浴下進行超聲波破碎，超聲波破碎液在4℃下、12000rpm/min離心10min去除細胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。