[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或飼料中植酸酶基因的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210400763.6
• 申請(qǐng)日: 2012-10-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876800A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊文竹;初曉宇;陳茹梅;伍寧豐;范云六;姚斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京市德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 余光軍

1.一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子的飼料中植酸酶基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；(2)以待檢測(cè)樣品的DNA為模板，分別以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對(duì)特異引物、擴(kuò)增植酸酶基因的一對(duì)特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對(duì)特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算出二次實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的Ct值差值，將Ct值差值代入步驟(1)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，得到待檢測(cè)樣品中植酸酶基因的含量。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立：

(1)制備轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA；(2)以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增玉米內(nèi)參基因的一對(duì)特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值；以所制備的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以擴(kuò)增植酸酶基因的一對(duì)特異引物或者是擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與植酸酶基因結(jié)合區(qū)域的一對(duì)特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因的Ct值；(3)建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。

3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(3)所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA含量為橫坐標(biāo)，建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；

步驟(3)所述的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測(cè)得到的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的基因組DNA含量為橫坐標(biāo)，建立定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。

4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(3)所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA中植酸酶基因組DNA含量的0.5％，1％，2％，5％，10％為橫坐標(biāo)，建立轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程；

步驟(3)所述的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程按照以下方法建立：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中的軟件記錄下檢測(cè)得到的含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA中內(nèi)參基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)DNA中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的基因組DNA含量的2％，5％，10％，20％，50％為橫坐標(biāo)，建立定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。

5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到：將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，即得；

所述含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到：將添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料基因組DNA與未添加轉(zhuǎn)基因玉米的飼料基因組DNA按照梯度比例混合，即得。

6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到：將轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組DNA與非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA按梯度比例混合，控制轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因DNA含量分別為0.5％，1％，2％，5％，10％；

所述含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按照以下方法制備得到：將添加有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的飼料基因組DNA與未添加轉(zhuǎn)基因玉米的飼料基因組DNA按照梯度比例混合，控制轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米飼料基因組DNA含量分別為2％，5％，10％，20％，50％。

7.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的玉米內(nèi)參基因是Maize?actin?1；所述植酸酶基因是PhyAO基因。