[發(fā)明專利]一種恩拉霉素高產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210399132.7
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102864114A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王雪峰;閆彩潔;劉衛(wèi)哲
• 申請（專利權(quán)）人: 河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P21/04;C12R1/465
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡?biāo)事務(wù)所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

1.一種恩拉霉素高產(chǎn)菌株，其特征在所述菌株保藏名稱是殺真菌鏈霉菌（Streptomyces?fungicidious）DCS067，保藏單位CGMCC，保藏號是CGMCC?No.6220，保藏日期2012年6月14日。

2.權(quán)利要求1所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a、制備孢子懸液Ⅰ：取殺真菌鏈霉菌的出發(fā)菌株，接種于斜面培養(yǎng)基上，在28.0±0.5℃、相對濕度40-60%條件下培養(yǎng)5-8天，然后加入無菌水，將孢子刮下，混勻，得到孢子懸液Ⅰ；

b、有機溶劑處理：向孢子懸液Ⅰ中無菌有機溶劑，振蕩后靜置，分層，取水相得到孢子懸液Ⅱ；

c、紫外誘變：將孢子懸液Ⅱ置于滅菌的培養(yǎng)皿中，于波長254nm的紫外燈下照射45-60s；

d、抗性篩選：將誘變處理后的孢子懸液Ⅱ涂布在含有抗生素的分離培養(yǎng)基上，在28.0±0.5℃、相對濕度40-60%條件下培養(yǎng)5-8天，生成具有抗生素耐藥性的若干單菌落；分別挑取上述單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上，在28.0±0.5℃、相對濕度40-60%條件下培養(yǎng)5-8天后，接種于種子培養(yǎng)基上，在28.0±0.5℃，200~220?rpm條件下培養(yǎng)26-30h后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，在28.0±0.5℃，200~220?rpm條件下培養(yǎng)9-12天，得到發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中恩拉霉素效價，選取效價最高的發(fā)酵液對應(yīng)的菌株即為殺真菌鏈霉菌（Streptomyces?fungicidious）DCS067。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，所述孢子懸液Ⅰ中孢子濃度為1011-1013個/mL或吸光度A600為1.0-2.0，所述有機溶劑為苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、二甲苯中的任意一種或幾種的混合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑是體積比為25:4的苯酚、三氯甲烷的混合物。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，按質(zhì)量體積比計算，所述斜面培養(yǎng)基的成分為：0.5-1.0%麥芽糖粉，0.05-0.10%干酵母粉，0.05-0.10%金槍魚膏，0.06-0.12%胰蛋白胨，0.1-0.5%氯化鈉，1.8-2.2%瓊脂，其余為水；所述分離培養(yǎng)中抗生素的含量為0.1~0.7μg?/mL，其余成分及含量與斜面培養(yǎng)基相同，上述斜面培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基均采用質(zhì)量百分含量為30%的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至6.7±0.1。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，c步驟所述抗生素是鏈霉素。

7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，按質(zhì)量體積比計算，d步驟所述種子培養(yǎng)基的成分為：2.5-4.5%玉米粉，0.2-0.8%玉米蛋白粉，0.2-0.8%棉籽餅粉，1.5-2.5%輕質(zhì)碳酸鈣，0.15-0.35%硫酸銨，0.02-0.05%硫酸亞鐵，0.05-0.25%磷酸二氫鉀，1.5-3.5%玉米漿，其余為水，該培養(yǎng)基采用質(zhì)量百分含量為30%的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至6.7±0.1。

8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述恩拉霉素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，按質(zhì)量體積比計算，d步驟所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0.2-0.8%輕質(zhì)碳酸鈣，0.2-0.8%氯化鈉，0.1-0.5%硫酸銨，0.003-0.012%硫酸亞鐵，0.007-0.027%磷酸二氫鉀，0.1-0.5%尿素，0.005-0.015%氯化鋅，0.05-0.25%氫氧化鉀，0.07-0.15%玉米漿，0.1-0.5%L-乳酸，0.04-0.12%耐高溫α-淀粉酶，其余為水，該培養(yǎng)基采用質(zhì)量百分含量為30%的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5.9±0.1。

9.權(quán)利要求1所述菌株在恩拉霉素生產(chǎn)中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述菌株在恩拉霉素生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于，在28.0±0.5℃，200~220?rpm條件下，將DCS067菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵9-12天，制得含有恩拉霉素的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0.2-0.8%輕質(zhì)碳酸鈣，0.2-0.8%氯化鈉，0.1-0.5%硫酸銨，0.003-0.012%硫酸亞鐵，0.007-0.027%磷酸二氫鉀，0.1-0.5%尿素，0.005-0.015%氯化鋅，0.05-0.25%氫氧化鉀，0.07-0.015%玉米漿，0.1-0.5%L-乳酸，0.04-0.12%耐高溫α-淀粉酶，其余為水，該培養(yǎng)基采用質(zhì)量百分含量為30%的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至5.9±0.1。