[發明專利]一種提高α-熊果苷產量的方法

無效

• 申請號: 201210399102.6
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103773827A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 王芳;劉春巧;鄧利;張鵬;張淑榮;譚天偉;聶開立;劉珞
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P19/44
• 分類號: C12P19/44;C12N1/20;C07H15/203;C07H1/06;C12R1/64
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及利用大孔吸附樹脂固定化對苯二酚，通過野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243發酵催化固定化對苯二酚與雙糖合成α-熊果苷的制備方法。?

背景技術

α－熊果苷具有顯著抑制酪氨酸酶的活性，可以減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效。在比較α-熊果苷與其同分異構體β-熊果苷的美白效果時，Kazuhisa?Sugimotod等通過人體黑素瘤細胞的實驗，發現α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上。目前，α－熊果苷是國際公認的并正在極力推廣的高效、安全的美白劑，是美白、祛斑、防曬化妝品理想的添加成份。?

作為α－熊果苷合成反應物的對苯二酚具有殺菌作用，它可以通過降低細胞內巰基水平及升高活性氧水平改變細胞內氧化還原狀態而引起細胞凋亡。當α-熊果苷合成反應體系中對苯二酚濃度超過一定量時,會對菌體產生抑制作用，導致菌體催化能力下降，不利于α－熊果苷的生產。因此，研究一種既可以提高反應體系對苯二酚濃度又可以降低其毒害作用的方法，成為大規模低成本生產α－熊果苷的必然選擇。?

固定化(immobilized)技術是用化學或物理手段將物體定位于限定空間區域的一門新興技術，在化工、發酵、能源、醫藥等行業應用廣泛。大孔吸附樹脂是一類具有大孔結構的高分子吸附樹脂，有良好的大孔網狀結構和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物，具有物理化學穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構成閉路循環、節省費用等諸多優點，已在環保、食品、醫藥等領域得到了廣泛的應用。?

目前，由于利用化學合成方法很難合成α－熊果苷，所以關于α－熊果苷的制備方法主要通過生物轉化法來實現。如今關于α－熊果苷生產的報道主要有日本Kohtaro?Kirimura，國內張鵬、李群良、姜岷、龐宗文及杜剛等。但這些方法均存在以下一些問題：?

一、催化劑（菌體或酶）對對苯二酚的耐受度不高，導致α－熊果苷的產量也不高；?

二、α-熊果苷轉化率不高，導致原材料利用率不高；?

三、產物α－熊果苷后續分離純化工藝復雜、設備投資及操作費用均較大；?

四、生產過程有含對苯二酚廢水產生，污染環境。?

為了克服這些問題，固定化對苯二酚是最好的解決辦法。通過把對苯二酚固定在大孔吸附樹脂上，使得發酵液溶液中的對苯二酚濃度基本為零，菌體的生長代謝將不受任何影響，可以更好地催化合成α－熊果苷；此外，把對苯二酚固定在大孔吸附樹脂上，可以大大提高催化劑對對苯二酚的耐受度，提高單位體積發酵液中對苯二酚的濃度，從而大大提高α－熊果苷的產量；再者，待反應結束后，產物和未反應的對苯二酚依然固定在樹脂上，產物后續處理只需用簡單過濾即可把產物和發酵液進行有效分離，大大簡化了后續產物分離純化工藝及設備投資，并減少了發酵液中含對苯二酚廢水排放，對環境的污染基本沒有。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，利用固定化對苯二酚提高菌體對對苯二酚耐受度，提高單位體積發酵液中對苯二酚的濃度，進而提高α－熊果苷的產量。其中固定化對苯二酚即采用大孔吸附樹脂吸附法對對苯二酚進行固定化，并用此固定化對苯二酚作為野油菜黃單胞菌CGMCC?NO.1243催化合成α－熊果苷的反應物，在最佳反應條件下催化合成α－熊果苷。該方法具有提高菌體對對苯二酚的耐受度，簡化產物后續分離純化工藝，減少含酚廢水排放等優點，大大降低了α－熊果苷生產成本低，為大規模低成本生產α－熊果苷奠定了基礎。?

本發明的整體技術構思是：?

利用大孔吸附樹脂固定化對苯二酚作為野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243催化合成α-熊果苷的反應物，該方法由下列工藝步驟組成：?

（1）固定化對苯二酚的制備；?

（2）野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243的發酵，其中包括種子培養和發酵罐培養；?

（3）加入固定化對苯二酚和雙糖進行合成反應；?

（4）α-熊果苷的分離純化。?

本發明的具體工藝步驟及工藝條件是：?

步驟（1）中固定化對苯二酚的制備：?