[發明專利]一種鑒定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸點突變及其對苯酰菌胺抗藥性的方法

無效

• 申請號: 201210398727.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102925565A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 劉西莉;蔡萌;陳磊;畢揚;林東;李波濤;李健強;劉鵬飛
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12N15/11;C12N15/31;C07K14/37
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技術領域

本發明涉及大豆疫霉β-微管蛋白基因的克隆及其在殺菌劑苯酰菌胺抗性監測中的應用，具體公開一種快速鑒定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸點突變及其對苯酰菌胺抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學技術領域。

背景技術

大豆疫病是由大豆疫霉(Phytophthora?sojae?Kaufmann&Gerdemann)引起的一種具有危險性、毀滅性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可發病，其中感病品種一般減產25％～50％，高感品種可達90％以上，甚至絕收；并且籽粒蛋白含量明顯下降，使用價值受到影響。該病害自1948年在美國印第安納州東北部首次被發現后，迅速擴展到巴西、阿根廷等20多個國家。在我國則主要發生在黑龍江、安徽、福建等省，為重要的外檢和內檢病害。

大豆疫霉為同宗配合的卵菌，自然條件下即可發生有性生殖，加速了基因的重組與交換，使得田間大豆疫霉菌株的遺傳多樣性越來越豐富；而且大豆疫霉生理小種毒性變異明顯，新小種層出不窮，許多大豆抗性基因已被新的小種所克服，抗病資源失去效用。而化學防治的快速有效，使之成為該病害防治中較為重要的措施。但目前國內外專門用于卵菌病害防治的殺菌劑種類較少，其中最具有代表性的是以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，是第一代專門用于防治卵菌病害的一大類重要的內吸性殺菌劑。然而，由于該類殺菌劑的作用位點較為單一，而且大面積廣泛使用，致使病原菌對該類藥劑的抗藥性接踵而至，并且發展迅速，目前病原菌對甲霜靈的抗性問題已尤為嚴重。而苯酰菌胺(zoxamide)則是在此背景下應運而生的一種對卵菌具有特效的苯甲酰胺類殺菌劑，是目前市場上唯一一種作用于微管蛋白的殺卵劑。該類殺菌劑在2001年開始商品化，并已在歐美地區廣泛使用，在我國也已正處于登記推廣當中。

盡管苯酰菌胺主要用來防治卵菌病害，它對Botrytis?cinerea、Venturia?inaequalis、Monilinia?fructicola、Mycosphaerella?fijiensis和Cercospora?beticola等病原真菌也具有一定的活性。已有研究表明苯酰菌胺與苯并咪唑類殺菌劑具有類似的作用機制，均作用于靶標菌的β-微管蛋白。以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑在田間使用后，抗藥性問題很快產生并日益嚴重，FRAC(Fungicide?Resistance?Action?Committee)將其列為高等抗性風險的殺菌劑。已有報道表明，苯并咪唑類殺菌劑的抗性主要是由于病原菌β-微管蛋白第198位和200位氨基酸發生了位點突變所造成，并且已建立了相應的田間快速檢測方法，包括等位基因特異性PCR(Allele-specific?polymerase?chain?reaction，AS-PCR)等。目前，大豆疫霉對苯酰菌胺的抗藥性分子機制還未明確，而明確其具體的抗性基因，建立抗性分子檢測方法，可以對抗性菌株進行早期檢測，了解其抗性發展的動態，制定合理的病害管理方案，以延緩抗藥性的產生。

傳統生物學方法和分子生物學方法是植物病原菌抗藥性檢測或監測中常見的兩種方法。傳統生物學方法即是指測定藥劑對病原菌的EC₅₀以區分敏感和抗性菌株，需要多個藥劑處理，多次重復，檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多；而且這種方法檢測靈敏度低，要求抗藥性菌株的突變頻率在1％以上。而分子生物學方法，從提DNA到特異性PCR或酶切分析，檢測所需時間短、檢測的靈敏度高，檢測頻率在10^-5～10^-4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。

發明內容

本發明旨在提供一種檢測或輔助檢測大豆疫霉中β-微管蛋白基因是否存在突變位點的方法及其專用引物對。

本發明所提供的檢測或輔助檢測大豆疫霉中β-微管蛋白基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟：

以待測大豆疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為288bp的片段，則所述待測大豆疫霉中β-微管蛋白基因存在或候選存在突變位點；

所述突變位點是指大豆疫霉中β-微管蛋白基因的基因組序列自5’末端起第716位核苷酸為C。

所述大豆疫霉中β-微管蛋白基因的基因組序列自5’末端起第716位核苷酸也就是SEQ?ID?NO：3中自5’末端起第716位核苷酸。

上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為67℃。