[發明專利]利用陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA的方法

有效

• 申請號: 201210398685.0
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103768590B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 高軍;白珠穆;李旭;李慶岸;杜鵬;于海
• 申請（專利權）人: 遼寧成大生物股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司21107
• 代理人: 韓輝

技術領域

本發明涉及一種在疫苗制品中去除宿主DNA及雜蛋白的方法，特別是涉及一種利用陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA的方法。

背景技術

乙腦疫苗是將乙腦病毒接種于適合的動物細胞上，經繁殖后病毒釋放到培養液中，與此同時一些殘余的宿主細胞或其碎片也會進入到培養液中，經澄清，超濾濃縮，凝膠過濾層析后，提取得到的乙腦疫苗原液中會產生游離的宿主DNA及與抗原蛋白結合的宿主DNA，原液中還含有大量的宿主蛋白，濃縮、凝膠過濾層析工藝會將一定比例的游離DNA去除，但仍會有殘余DNA存在，特別是與病毒或抗原蛋白結合的DNA會殘留在原液中，若去除不徹底，這部分DNA會隨著疫苗一起被注入到人體內，可能會在人體內引起不良反應，或具有癌癥發生的可能。

目前乙腦疫苗普遍采用濃縮、凝膠過濾層析等傳統工藝進行提取，所得到的乙腦疫苗，存在以下缺陷：

1、病毒疫苗提取后殘留的宿主DNA含量過高。

2、病毒疫苗提取后仍含有過高的宿主蛋白，雜蛋白去除率不高，導致疫苗在臨床使用后有較大的副作用。

3、上述缺陷，影響了病毒疫苗產品的質量，制約了疫苗產品的生產。

發明內容

本發明的目的就在于克服現有技術存在的上述不足，為了實現在處理乙腦疫苗的過程中盡可能不損失抗原，即不影響疫苗制品的藥效，又有效地去除雜蛋白及殘留宿主DNA的目標，本發明提供一種利用陰離子交換層析去除乙腦 疫苗制品中殘留DNA的方法，即將濃縮、凝膠過濾層析所獲得的初步純化液加載到陰離子交換介質中，在一定的PH、離子強度下，DNA牢固吸附在介質上而病毒蛋白直接穿透，從而使成品乙腦疫苗DNA殘留量達到合格標準。

本發明給出的技術方案是：利用陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA的方法，其特點是：將凝膠過濾層析所獲得的病毒蛋白溶液進行陰離子交換層析，使DNA牢固吸附在離子交換介質上而病毒蛋白穿透，從而達到去除宿主DNA的目的。

具體步驟為：

將乙腦疫苗濃縮液經過BPG200層析柱，Sepharose 4Fast Flow或Sepharose6Fast Flow凝膠過濾層析，紫外檢測波長280nm，流速為6cm/h，流動相為pH7.4的10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)，收集第一個吸收峰，即乙腦病毒蛋白初步純化液；

再用pH7.2-7.8，的10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)平衡陰離子層析柱至紫外、電導平衡，流速3cm/h；

然后將初步純化液按2倍柱床體積加載到陰離子層析介質中，流速為2cm/h，宿主DNA牢固吸附在陰離子層析介質上，而乙腦病毒蛋白與離子交換介質的結合位點被緩沖液中的離子取代，直接穿透，紫外檢測波長280nm，收集吸收峰，當樣品全部加載后，繼續用10mmol/L PBS(NaCl 0.2-0.6mol/L)緩沖液洗滌離子柱2倍柱床體積，直到紫外吸收值降到基線，收集的穿透峰為最終純化液。

與現有技術相比，本發明的創新之處在于，在保證疫苗抗原原始結構的前提下，有效去除宿主DNA的含量，突破疫苗制品的質量瓶頸，提高產品質量及合格率。

附圖說明

下面結合實施例及圖譜詳盡說明本發明。

圖1是乙腦濃縮液直接進行Sepharose 4Fast Flow凝膠過濾層析的圖譜。

圖2是乙腦濃縮液進行Sepharose 4Fast Flow凝膠過濾層析后，再進行DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析的圖譜。

圖3乙腦濃縮液進行Sepharose 4Fast Flow凝膠過濾層析后，再進行QSepharose Fast Flow陰離子交換層析的圖譜。

圖4乙腦濃縮液進行Sepharose 4Fast Flow凝膠過濾層析后，再進行CaptoQ陰離子交換層析的圖譜。

圖5乙腦濃縮液直接進行Sepharose 6Fast Flow凝膠過濾層析的圖譜。

圖6乙腦濃縮液進行Sepharose 6Fast Flow凝膠過濾層析后，再進行QSepharose Fast Flow陰離子交換層析的圖譜。

圖7乙腦濃縮液進行Sepharose 6Fast Flow凝膠過濾層析后，再進行CaptoQ陰離子交換層析的圖譜。

圖8是DNA殘留量檢測圖譜。