[發明專利]一種流感病毒滴度的檢測方法

有效

• 申請號: 201210397723.0
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103773892A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 周荔葆;廖輝;劉苗苗;趙新;吳瓊;曲格霆
• 申請（專利權）人: 遼寧成大生物股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 韓輝

1.一種流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于：采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度，其步驟有：

(1)將流感病毒按10倍系列稀釋，取各稀釋度病毒液加入Vero細胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每個稀釋度加4孔，，35℃吸附90min后倒掉病毒液；

(2)加入保持37℃～42℃的第一層覆蓋物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培養72小時；

(3)加入保持37℃～42℃的第二層覆蓋物，每孔2ml，完全凝固后，35℃倒置培養24～48小時判定結果，選擇出斑數在10～100個進行數斑；

(4)根據Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度：

(5)將流感病毒稀釋至每0.5ml含1～5個病毒(即每孔1～5個空斑)，分別用雞胚法和空斑法檢測流感病毒感染滴度，檢測陽性檢出率，比較兩種方法的靈敏度；

(6)分別采用終濃度為1％和0.5％的Agarose覆蓋物，進行試驗操作，比較不同的終濃度對出斑的影響；

(7)35℃培養箱流感病毒分別吸附60min和90min后加入第一層覆蓋物，比較不同吸附時間對出斑的影響；

(8)流感病毒在33℃和35℃培養時能很好的繁殖，但在較高溫度時繁殖減弱，甚至不繁殖；

(9)按上述方法，五個不同操作者同時用空斑法檢測同一個流感病毒感染滴度，分別重復5次以上，對結果進行分析。

2.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的病毒稀釋液為含6ug/ml胰酶的無血清培養基。

3.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第一層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養基43.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3?3ml、HEPES?1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、雙抗1ml。

4.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第二層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養基38.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3?3ml、HEPES?1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、雙抗1ml、中性紅5ml。

5.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持40℃的第一層覆蓋物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培養72小時。

6.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持40℃的第二層覆蓋物，每孔2ml，完全凝固后35℃倒置培養24～48小時判定結果。

7.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時選擇出斑數在30～70個進行數斑。

8.根據權利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的