[發(fā)明專利]一種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法無效

申請?zhí)枺?/td>	201210397631.2	申請日：	2012-10-18
公開（公告）號：	CN103773754A	公開（公告）日：	2014-05-07
發(fā)明（設計）人：	高旭哲	申請（專利權）人：	遼寧成大生物股份有限公司
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10;C12Q1/68
代理公司：	沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107	代理人：	韓輝
地址：	110179 遼***	國省代碼：	遼寧;21
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種熒光檢測 dna 殘留實驗提取方法
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【說明書】：

技術領域

本發(fā)明涉及一種生物制備中的實驗方法，特別是涉及一種生物制品中宿主細胞DNA殘留量檢測及微量基因組DNA提取的熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法。

背景技術

細胞基質作為主要原材料，其質量的優(yōu)劣，直接影響疫苗等生物制品的質量和產量，尤其是生物制品的安全性。一般認為，細胞基質存在的潛在危險因素包括：促生長蛋白及細胞殘留蛋白、潛在病毒、細胞DNA。其中殘余DNA一直是人們關注的熱點。由于連續(xù)傳代細胞(continuous?cell?lines)調控生長的基因失調，使得傳代細胞系具有無限的壽命。因此，理論上認為傳代細胞系的DNA具有使其他細胞生長失控和產生致瘤活性的潛在能力，需要對其DNA殘留量進行質量控制。

DNA提取技術是分子生物學研究的基礎技術。DNA提取技術是DNA檢驗的第一步驟，也是最關鍵的步驟。能否成功地定量進行DNA檢驗，完全取決于能否從樣品中獲得全量的DNA。DNA提取技術的優(yōu)劣，將直接關系到最終檢驗結果。

殘余DNA分析需要對mg級樣本中pg水平的DNA進行準確定量。樣本本身，無論是蛋白還是其他化學成份，都可能產生基質效應從而影響檢測過程，因此需要對有干擾樣本進行前期處理。蛋白樣本通常需要進行蛋白酶消化。傳統(tǒng)的DNA抽提方法是分子生物學中常用的酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法，但這種抽提方法通?；厥章瘦^低，因此像糖原等載體分子的應用對于回收率的提高是必不可少的。美國藥典USP32中推薦了一種商品化DNA提取試劑盒，它是利用離液劑(碘化鈉)和表面活性劑(N月桂酰肌氨酸鈉)來破壞DNA和樣本的結合，然后DNA和載體分子糖原共同被異丙醇沉淀下來。

磁珠抽提DNA的方法是利用糖原、酵母tRNA將樣本中殘余DNA吸附于磁珠微粒上，利用磁力架進行DNA抽提，該方法的回收率能達到80％～100％。

樣本提取是一個額外的處理步驟，可能會引起殘余DNA不完全回收或引入環(huán)境中外源性DNA，因此在樣本處理的每一步都需要格外細心，同時增加回收率試驗進行評價。USP32中指出加標回收率在80％～120％是殘余DNA檢測中可以接受的標準。當樣本中存在干擾因素或抽提過程達不到這一回收率范圍時，可以通過加標回收率校正DNA檢測結果。

在采用picogreen或Q-PCR等以熒光方式檢測疫苗中宿主DNA殘留量實驗中，對樣品中殘留DNA的提取條件要求苛刻，不僅在樣品回收率方面，在整個提取過程中引入外來試劑的殘留都會對熒光信號產生影響。進而影響最終結果。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術的上述不足，公開一種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法。

本發(fā)明采用一種新的DNA提取技術(磁珠提取)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酚氯仿法提取疫苗中的殘留DNA。并用PicoGreen試驗驗證此技術(磁珠提取)可以降低了污染物質(如酚?異丙醇、氯化鈉等)對熒光信號的影響，從而得到相對準確的檢驗結果。

本發(fā)明給出的技術方案是：這種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法，其特征在于有以下步驟：

(1)磁珠法提取樣品中殘留DNA提取

A、消化蛋白酶反應

在1.5ml離心管中加入樣品100μl，加入0.2％蛋白酶K溶液20μl，加入蛋白酶K緩沖液200μl，56℃培養(yǎng)30min，培養(yǎng)后每管加肝素40μg、2μg?tRNA；

B、磁珠綁定DNA

將磁珠重懸、震蕩混勻后，每管加15μl磁珠；再加入200μl無水乙醇、倒轉2次、漩渦混勻5min、spin15s、磁力架靜止5min，吸除懸浮液體；

C、清洗DNA

1)從磁力架取下，加500μl緩沖液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s；