[發(fā)明專利]一種可分泌的綠色熒光蛋白及其在重組蛋白高產(chǎn)表達細胞株篩選方面的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210394984.7
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN103773770A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高峰;石磊;唐文英;劉新軍;孫雷
• 申請（專利權(quán)）人: 高峰;石磊
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)領(lǐng)域，其技術(shù)屬于分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的相關(guān)實驗方法與技術(shù)，特別是一種可用于穩(wěn)定高表達細胞系構(gòu)建的分泌型綠色熒光蛋白。?

背景技術(shù)：

綠色熒光蛋白(Green?Fluorescent?Protein，簡稱GFP)是一種在學(xué)名為Aequorea?victoria的水母中所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)(Morin，J.G.J.Cell?Physiol.(1971)77，305-318)。在它包含238個氨基酸的序列中，第65至67個氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團，因此在有激發(fā)光的照射下可以自發(fā)熒光，而不需要借助底物或其他的共同作用因子(Tsien，R.Y.Annu.Rev.Biochem.(1998).67：509-544.)隨著生物技術(shù)的進步，GFP報告基因還被用于基因組范圍的表達調(diào)控分析，蛋白質(zhì)在體內(nèi)的亞細胞定位研究以及蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)運動的實時觀測(J?M?Tavaré等Journal?of?Endocrinology.(2001).170，297-306)。GFP可以在細菌，酵母，昆蟲表達系統(tǒng)及轉(zhuǎn)基因動植物中用作報告基因，構(gòu)建出高表達報告基因的實驗?zāi)Ｐ?Chalfie，M.等Science(1994)263，802-805；Plautz?JD等(1996)Gene173：83-87；Suzuki?J等(2006)J?Biotechnol126：463-474；Blumenthal?A等Plant?Sci(1999)142：93-99)。?

然而隨著生物制藥工業(yè)的發(fā)展，對重組蛋白越來越多的需求量，使得在盡可能短的時間內(nèi)構(gòu)建得到的盡可能穩(wěn)定高表達生產(chǎn)用細胞系成為生物技術(shù)發(fā)展的方向和目標。而不論是利用GFP指示目的蛋白的表達還是指示高效表達的位點，尋找到表達足夠高并且穩(wěn)定的細胞系都是其中的關(guān)鍵步驟(Qiao，J.等Molecular?Biology(2009)390(4)：579-59)這需要進行構(gòu)建和篩選大量的細胞克隆，進而快速比較他們的產(chǎn)量，并且要求篩選到表達高的細胞要保持穩(wěn)定的表達水平。?

雖然GFP有其高通量篩選的優(yōu)勢，但是在細胞系構(gòu)建上GFP仍存在一些負面的影響。一方面GFP在抑制細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡方面的作用，使得在許多細胞中，不易構(gòu)建穩(wěn)定表達GFP的細胞系(Hsiao-Sheng?Liu等Biochemical?and?Biophysical?Research?Communications(1999)260(3)：712-717)，這制約了篩選到表達GFP足夠高的細胞克隆。另一方面GFP作為胞內(nèi)蛋白，比較不同細胞克隆產(chǎn)量的高低需要裂解細胞進行檢測或進行流式分析，這降低了細胞克隆的分析通量，并且不便于比較細胞克隆的穩(wěn)定性。另外由于流式分析方法成本高，操作步驟復(fù)雜，實踐中只能通過比較單一代次的變化來評判細胞穩(wěn)定性。而單一代次的比較可能出現(xiàn)一定的誤差，并且無法準確反映細胞產(chǎn)量變化趨勢。因此如何簡單便捷的檢測目的基?因表達水平的變化并且準確判斷出穩(wěn)定的細胞克隆也是工業(yè)上篩選高表達細胞系的關(guān)鍵步驟。?

因此改進GFP，保留其熒光特性同時降低其對細胞生長的負面影響和不易于檢測的性質(zhì)，開發(fā)出可以快速簡便檢測的熒光蛋白，可以為工業(yè)上進行細胞構(gòu)建提供新的報告基因和開發(fā)手段。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是為了解決上述背景技術(shù)存在的不足，構(gòu)建得到一種分泌型的綠色熒光蛋白——SEGFP，為篩選高表達穩(wěn)定的工程細胞系提供了新的思路。?

本發(fā)明的目的按下述方案實現(xiàn)：根據(jù)原有的GFP蛋白的序列，在其N端加上一段人IgGkappa鏈的信號肽序列，構(gòu)建一種分泌型綠色熒光蛋白。轉(zhuǎn)染分泌型綠色熒光蛋白至哺乳動物細胞CHO中，并在細胞外檢測到該蛋白的分泌。利用該蛋白構(gòu)建了穩(wěn)定表達的細胞系，并且該蛋白可用于細胞系的表達水平及表達穩(wěn)定性的比較。分泌型熒光蛋白還可以用于流式細胞儀的分選。?

本發(fā)明的突出優(yōu)點是SEGFP可以分泌到細胞外的特點，可以使其方便用于細胞克隆篩選，并可以快速檢測細胞克隆的蛋白表達水平及分析細胞克隆的表達穩(wěn)定性，大量節(jié)省了實驗成本，為篩選出高表達的工程細胞株提供新的工具。?

附圖說明：

圖1.Western?Blotting檢測分泌型綠色熒光蛋白的表達水平。L：細胞裂解液；S：培養(yǎng)液上清?

圖2.分泌型綠色熒光蛋白細胞克隆表達水平的分析?