[發明專利]奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測試劑盒的制備方法

有效

• 申請號: 201210394431.1
• 申請日: 2012-10-17
• 公開（公告）號: CN102851390A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 陳德坤;姚運亮;田婷婷;許君艷;趙燕青;羅軍;曹斌云
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/19;C12R1/46;C12R1/22
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

一、技術領域：

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測試劑盒的制備方法。

二、背景技術：

羊奶及其奶制品有著優良的營養價值和巨大的經濟效益，而在羊奶的重要來源奶山羊養殖業中，乳房炎是一種廣泛流行的傳染性疾病，降低原奶產量及其質量，甚至帶來嚴重的經濟損失。引起乳房炎的重要原因是致病菌感染乳房，主要的乳房炎致病菌有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus，S.?aureus）、大腸桿菌（Escherichia?coli，E.?coli）、乳房鏈球菌（Streptococcus?uberis，S.?uberis）、停乳鏈球菌（Streptococcus?dysgalactiae，S.?dysgalactiae）、無乳鏈球菌（Streptococcus?agalactiae，S.?agalactiae）、克雷伯氏菌（Klebsiella?pneumonia,?K.?pneumonia）。對乳房炎致病菌的檢測、鑒定，不僅是判斷產奶母畜是否患有乳房炎的重要依據，而且為臨床預防、治療乳房炎提供有效的信息。傳統的致病菌檢測以細菌分離、生化鑒定實驗為基礎，假陰性率高且耗時。

三、發明內容：

本發明的目的在于提供一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測試劑盒的制備方法，對提高乳房炎的檢測、監控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意義。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為?：一種奶山羊乳房炎病原菌多

重PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的制備方法為：

1）待檢樣本DNA提取；

2）設置PCR檢測試劑盒：由PCR試劑管、陽性對照、陰性對照、Taq?DNA聚合酶、溴酚藍上樣緩沖液（常規使用濃度）組成；

3）PCR擴增：在PCR檢測管中加入預處理的DNA樣本及Taq?DNA聚合酶，同時設置陽性、陰性對照，微量移液器吹打混勻后瞬間高速離心，PCR儀進行擴增反應；

????4）PCR擴增產物分析：將上述PCR擴增產物進行凝膠電泳，與陽性、陰性對照比較待檢樣本所出現的電泳條帶，以判斷待檢樣品是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌的單一或混合感染。

所述的步驟3）中的PCR進行擴增反應的反應循環條件為：95?℃預變性4?min，94?℃變性1?min，60.5?℃退火90?sec，72?℃延伸1?min，30個循環后72?℃延伸8?min，保存PCR產物于4?℃待檢。

所述的多重PCR檢測試劑盒是以原有的PCR檢測技術為基礎，將多個單一PCR置于同一反應體系、同一反應條件中進行，同時達到對多種致病菌的檢測。

與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下：

1、一種對奶山羊金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌單一或混合感染乳房，引起乳房炎的多重PCR檢測方法，可快速、高效、準確的檢測出待檢個體是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌致病菌的單一或混合感染，此外本試劑盒也可用于奶山羊感染金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌的分子流行病學調查及療效監測。本方法以分子生物學知識為基礎，避免了傳統檢測方法鏡檢時的細菌、雜質顆粒干擾，從而大大提高了診斷準確率。

2、本發明建立6種乳房炎主要致病菌的多重PCR快速檢測試劑盒，可同時達到對多種致病菌的檢測，是一種省時、高效的檢測方法，可為臨床、亞臨床乳房炎的治療提供科學依據，而且對提高乳房炎的檢測、監控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意義。

四、附圖說明

圖1為各個菌種的單重PCR檢測結果圖（M：?100?bp?DNA?ladder;?1：大腸桿菌;?2:?停乳鏈球菌;?3:?金黃色葡萄球菌;?4:?無乳鏈球菌;?5:?乳房鏈球菌;?6:?克雷伯氏菌;?7:?陰性對照）；

圖2為多重PCR凝膠電泳結果圖。

五、具體實施方式

本發明多重PCR檢測，是以原有的PCR檢測技術為基礎，將多個單一PCR置于同一反應體系、同一反應條件中進行，可同時達到對多種致病菌的檢測，